PCR技术(演示实验).doc

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1、实验四PCR技术（演示实验）一、实验目的1.掌握聚合酶链式反应的原理。2.掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。二、实验原理PCR技术，即聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）是由美国PECetus公司的KaryMullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。PCR可以被认为是与发生在细

2、胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。细胞中DNA的复制是一•个非常复杂的过程。参与复制的有多种因素。PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。PCR由变性--退火.-延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94°C左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；%1模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55°C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；%1引物的延伸：

3、DNA模板.•引物结合物在77/0酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性■■退火■■延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链"，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2〜4分钟，2〜3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。三、实验试剂与器材模板DNA、2.5mmol/LdNTPTaqDNA聚合酶（5U/pL）、SSR引物10Xbuffer>15mmol/LMg*、ddHzOPCR仪、移液枪、PCR板四、实验步骤1、配制20

4、iL反应体系，在PCR板中依次加入下列溶液：模板DNA2pL

5、引物11)1L引物21)1LdNTP1.5

6、iLMgCl22gL10Xbuffer2

7、iLddH2OlOgLTaq酶0.5pL2、设置PCR反应程序。94°C3min94°C45s、55°C45s>30个循环72°C45s72°C5min4°CIh3、上样，启动反应程序。4、扩增产物的电泳检测。五、思考题1、简述PCR的基本原理及其应用。附PCR技术应用1、生命科学a、人类基因组计划随着的PCR日臻完善，科学家于2003年在完成的人类基因组“工作框架图”的基础上，经过整理、分类和排列后得到的更加准确、清晰、完整的基因组图谱。这是对人类基因组基本面貌的首次揭示，表明科学家们开始部分“读”出人类生

8、命“天书”所蕴涵的内容。b、后基因组计划人类基因组DNA序列图谱完成后，鉴定基因组多态性及其单倍型以及寻找其在生物和医学应用中重要成为人们关心的热点。以研究基因功能为核心的“后基因组时代''己经来临，大规模的结构基因组、蛋白质组以及药物基因组的研究计划己经成为新的热点。c、物种的分类、进化及亲缘关系可以进行物种进化的保守性分析及物种多态性分析、物种鉴定。2、医药a、疾病的诊断和治疗遗传性疾病：如地中海贫血、镰刀状细胞贫血、凝血因了缺乏等有遗传倾I何的疾病，尤其是老年性疾病，如糖尿病、高血脂症、甚至肿瘤中的一部分，均可预测；癌基因的检测和诊断：检测恶性肿瘤的标记物来诊断癌症等疾病；利用基因治疗方

9、法治疗肿瘤性疾病。b、致病病原体的检测检测范围包括细菌、病毒（SARS及禽流感病毒H5N1等）、原虫及寄生虫、霉菌、立克次体、衣原体和支原体等一切微生物。检测的灵敏度和特异性都远高于当前的免疫学方法，所需时间也L：达到临床要求，这对于难于培养的病毒（乙肝），细菌（如结核、厌氧菌）和原虫（如梅毒螺旋体）等来说尤为适用。c、DNA指纹、个体识别（DNA身份证）、亲子关系鉴别和法医物证可以用一根头发、一个细胞、一个精子来完成上述工作，这一领域也已发展到骨随或脏器移植配型。d、生物工程制药许多药物可通过工程菌和细胞来大量生产，如干扰素、白介素、促红细胞生长素等药物。e、转基因动物制药及疾病模型转基因动

10、物与医学及生物医药研究的关系越来越密切。近年来,各种人类疾病转基因动物模型不断建立。如转基因动物在遗传病、心血管疾病、肿瘤、高血压病、病毒性疾病、异种移植、输血医学、药理学研究中的应用；利用转基因动物■乳腺生物反应器生产药物蛋白，好比在动物身上建“药厂”，可以从动物乳汁中源源不断地获得具有稳定生物活性的基因产品。这是一种全新的药物生产模式，具有投资成本低，药物研制周期短和经济效益高等优点。3、农业