PCR实验技术总结.doc

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1、增加PCR的特异性：1J?rnncrsdesign这是最重要的一步。理想的，只同日的序列两侧的单一序列而非其它序列退火的primer要符合下面的一些条件a.足够长,18・24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的primer同样会降低特异性拼且降低产量b.GC：%40%〜60%c.5端和中间序列要多GC,以增加稳定性d.避免3端GCrich,最后3个BASE不要冇GC,或者最后5个冇3个不要是GC：（有人说：3*端最好是GC/CG/CC/GG。）e.避免3端的互补，否则容易造成DTMERf.避免于端的错配g.避免内部形成二级结构h.附加序列（RTsite,Promot

2、ersequence）加到5端，在算Tm值时不算,但在检测互补和二级结构是要加上它们i.使用兼并primer时，要参考密码子使用表，注意生物的偏好性,不要在引端使川兼并primer,并使用较高的primer浓度（luM-3uM）j.最好学会使用一种designsoftware.PP5,Oligo6,DNAstar,VectorNTI,Onlinedesignetal.*primer的另一个巫要参数是熔解温度（Tm）。这是当50%的primer和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证primer同目的序列有

3、效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55°C到70°Co退火温度一般设定比primer的Tm低5°C。设定Tm右儿种公式。右的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的primero有的是根据GC含量估算Tm确定primerTm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测primer的杂交稳定性。大部分计算器程序使用近邻分析法。根据所使用的公式及primer序列的不同，Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值,所冇退火温度只是一个起始点。可以通过分析儿个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5°C,

4、以2°C为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少primer-聚体和非特异性产物的形成。为获得最佳结果，两个primer应具右近似的Tm值oprimer对的Tm差界如果超过5°C,就会primer在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个primcrTm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5°C或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。2.stabilityofprimers定制primer的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的。

5、primer产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。定制primer以干粉形式运输。最好在TE$溶primer,使其最终浓度为100pM。TE比去离子水好，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核甘的水解。primer的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的primer储存在・20°C。以大于10pM浓度溶于TE的primer在・20°C可以稳定保存6个月，但在室温（15°C到30°C）仅能保存不到1周。干粉primer可以在・20°C保存至少1年，在室温（15°C到30°C）最多可以保存2个月。1.PCR产物的电泳检测时间—般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规

6、则甚致消失。2.假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没冇消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标木的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。酶失活：需更换新酶，或新门两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是

7、有时忘加Taq酶或滉乙锭。引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。右些批号的引物合成质量冇问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注巫引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引