酪氨酸抑制性测定实验方案.doc

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1、熟地黄提取液对酪氨酸酶的抑制作用研究一、仪器和药品：仪器：分光光度计、微量移液器（1ml）、电子天平、容量瓶（10ml、50ml、250ml）＞回流装置一套、沸石、抽滤装置、旋转蒸发仪、水浴恒温箱、烧杯和量筒若干。药品：熟地黄粉末（约50g）、体积分数50%的乙醇（200ml）、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、L-酪氨酸、酪氨酸酶、去离子水若干。二、实验方案：A、熟地黄有效成分的提取：1、干燥熟地黄粉末10.0g+体积分数50%的乙醇1OOmL,室温浸泡24ho2、烧瓶+沸石+上述浸泡液，回流提取3h,冷却后抽滤取滤液。残渣再次加50%乙醇100mL回流提取3h,冷却抽滤取滤液，

2、合并两次滤液。（回流温度约80°Co）3、将滤液置于旋转蒸发仪上60-65°C浓缩回收溶剂，得膏状提取物。4、称取适量膏状提取物+去离子水配置成1mg/mL溶液备用。B、磷酸缓冲溶液（PBS）的配制:1、称取磷酸氢二钠13.3984g,加去离子水溶解，转移至250mL容量瓶中定容得a液；另称取磷酸二氢钠6.9011g,加去离子水溶解,转移至250mL容量瓶中定容得b液。2、分别移取a、b两溶液各50mL至250mL容量瓶中，加去离子水定容，即得pH=6.8的磷酸缓冲溶液。C、L.酪氨酸溶液和酪氨酸酶溶液的配制:1、WL-酪氨酸25.6g,用PBS缓冲液定容于50mL容量瓶

3、中,即得L-酪氨酸溶液。2、称取酪氨酸酶0.3502g,用PBS缓冲液定容于10mL容量瓶中，即得酪氨酸酶溶液。（冰水浴中操作、保存。）D、酪氨酸酶活力的测定：（分光光度法测A475）用微量移液器分别按表一剂量准确移取a、b、c、d四组样液,置于37°C水浴中恒温10min后，各加入0.40mL酪氨酸酶溶液，混匀，37°C温育反应10min,迅速移入比色皿中，测得在475nm处的吸光度A,、Ab、A。、Aa,然后按下面的公式计算熟地提取液对酪氨酸酶的抑制率：抑制率=[1.(Ad-Ac)/(Ab-Aa)]X100%表一反应液的组成（单位：ml）待测液abcdL-酪氨酸0.0

4、00.800.000.80水*/提取物0.80*0.80*0.800.80PBS缓冲液1.400.601.400.60酪氨酸酶0.400.400.400.40合计2.602.602.602.60其中：a：既无底物也无提取物的待测液；b：有底物但无提取物的待测液；C：无底物但有提取物的待测液；d：既有底物也有提取物的待测液。!1E、扩展研究：（测定不同浓度提取物对酶的抑制作用影响）保持待测液各组分一样，仅仅是加入不同浓度的提取物，读取从开始2min后在475nm处的吸光度A,每分钟读取一次。以每分钟A475增加。.。。1为一个酶活力单位，酶促反应速度则用每分钟A475增加值

5、来表示。