VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂对兔耳增生性瘢痕抑制作用的实验分析

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1、-前言增生性瘢痕是整形美容外科常见病多发病，也是其他外科常面临的问题，严重的增生性瘢痕往往造成组织器官形态改变及功能障碍，影响患者的日常生活。目前对增生性瘢痕的病因及发病机制尚不完全清楚，但对其基础和临床的研究探讨从未中断。临床上大量的病例资料显示，处于增生期的瘢痕组织颜色发红，常常可见其表面增生扩张的毛细血管，用弹力绷带压迫一段时间或经过6-12个月的自然成熟期后，瘢痕组织表面血管扩张状态消失，瘢痕整体颜色转淡，质地变软，面积减小，出现退化表现。这提示瘢痕组织中大量毛细血管的生成及丰富的微循环血流与增生性瘢痕的发生发展有着密切的关

2、系。此外，在进行瘢痕切除手术时，处于增生期的瘢痕组织创面出血会明显多于成熟期瘢痕，进一步提示增生性瘢痕组织丰富的微循环血供。大量瘢痕组织学研究结果表明，增生期瘢痕组织成纤维细胞及毛细血管含量丰富，成纤维细胞和内皮细胞功能活跃并可见胶原等细胞外基质大量合成与分泌。随着分子生物学和细胞生物学的研究进展,近年来人们对增生性瘢痕形成的分子机制进行了大量研究,认为增生性瘢痕的形成与瘢痕内血管密度及血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)等细胞因子过表达有关。VEGF是一类糖蛋白，广泛分布于人

3、和动物体内的脑、肾、肝、脾、肺、骨骼等组织中。多种细胞均可分泌，如EC、EPC、骨髓基质细胞（marrowstromalcells,MSCs）、成纤维细胞等。增生性瘢痕中的VEGF主要由角质形成细胞、成纤维细胞等产生。VEGF的生物学功能包括:①作为血管内皮细胞特异性有丝分裂原，促进血管内皮细胞的增殖。②促进内皮细胞的变形、移动，使其进入胶原纤维之中，形成新生血管。③改变细胞外基质，使其有利于细胞生长。如激发VIII因子从内皮细胞释放，诱导基质胶原酶在内皮细胞表达等。④增加血管内皮的通透性，有利于蛋白质大分子外渗，部分外渗的蛋白质可

4、形成纤维蛋白原，支持内皮细胞生长[1]。⑤作为局部内生性调节剂，维护血管正常状态及完整性[2]。随着靶向血管治疗肿瘤新策略的倍受关注，VEGF及其受体VEGFR在抗血管治疗中的应用越10----来越受重视[3,4]。沈锐等[5]用VEGF抗体对增生性瘢痕动物模型进行靶向血管治疗，取得了一定的疗效。VEGF通过旁分泌和自分泌形式产生后，必须与相应的受体结合才能产生促进血管生成的效应，既往研究认为VEGF的受体分为三个亚型，包括VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3,分别有flt-1、flk-1/KDR、flt-4基因编码[6,

5、7]。Flt-1与VEGF结合引起内皮细胞的迁移和管样结构的维持，而KDR与VEGF结合主要刺激内皮细胞的增生，VEGFR-3则主要与淋巴内皮细胞增殖有关。VEGF受体属于跨膜受体，其胞内段有酪氨酸激酶结构域，属于受体酪氨酸激酶(receptortyrosinekinaseRTKS)超家族。近年来针对酪氨酸激酶这个位点研发出很多颇具临床应用前景的小分子化合物[8-10]，这些药物通过抑制受体的磷酸化，阻断相应的信号传导，达到抑制VEGF促进血管生成等生物学效应的目的。这些药物在抗肿瘤血管方面取得令人鼓舞的效果[11-13]，张朝然等

6、将VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂应用于对小鼠角膜新生血管抑制的研究，证实其对角膜新生血管有抑制作用，但是目前尚无局部应用VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂抑制增生性瘢痕血管生成的报道。本实验通过建立兔耳瘢痕模型，用VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂做瘢痕内局部注射，观察其对兔耳增生性瘢痕新生血管和胶原纤维形成的影响及其对瘢痕增生的抑制作用，为临床治疗瘢痕增生提供新思路，也为瘢痕防治药物的研发提供新的实验依据。----11----材料和方法1.实验动物新西兰大白兔16只，体重2-2.5kg，兔耳健全，雌雄不拘，购自南华大学动物试验部，分笼饲养。2.

7、实验材料2.1主要试剂1）血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（VEGFRTyrosineKinaseInhibitorII），编号：67648，购于德国默克公司。2）抗兔血管内皮生长因子抗体Anti—VEGF(Rabbit),编号：bs-1313R，购于北京博奥森生物技术有限公司。3）CD34抗体,购于北京博奥森生物技术有限公司。4）碱性成纤维细胞生长因子抗体Anti--BFGF/FGF-2,编号：bs-0217R，北京博奥森生物技术有限公司。5）兔SPKit免疫组化试剂盒RabbitSPKit编号：SP-0023，北京博奥森生物

8、技术有限公司。6）DAB染色试剂盒（25倍浓缩液），DAB（Diaminobenzidine），kit(25×)编号：0010，北京博奥森生物技术有限公司。7）逆转录试剂盒，长沙英韦创津生物科技有限公司。8）琼脂糖，长沙英韦创津生物科