动物生物化学实验讲义.doc

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1、动物生物化学实验讲义东北农业大学动物生化教研室实验项目1γ–球蛋白的分离实验项目2γ–球蛋白含量测定（光度分析法）实验项目3凝胶柱层析法（γ–球蛋白纯化）实验项目4SDS–聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS–PAGE）实验项目5动物组织中DNA的制备实验项目6多聚酶链反应（PCR扩增反应）实验项目7琼脂糖凝胶电泳分离DNA实验项目8转氨酶GPT活性的测定实验项目9氨基酸薄层层析实验项目10琥珀酸脱氢酶及丙二酸的抑制作用实验一γ–球蛋白的分离【原理】中性盐（如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠、硫酸镁等）对球状蛋白质的溶解度有显著影响。随着中性盐浓度的增

2、加，离子强度也增加。当溶液离子强度增加到一定数值时，溶液中蛋白质的溶解度开始下降。离子强度增加到足够高时，蛋白质可从水溶液中沉淀出来，这种现象叫做盐析。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的高浓度盐溶液来沉淀分离各种蛋白质。蛋白质是一种生物大分子，它具有不能通过半透膜的性质。透析就是利用这种性质使之与其它小分子物质如无机盐、单糖等分开。本次实验应用的是脱盐透析，即盐析后，将含大量盐类的蛋白质溶液放在半透膜的袋内，再将透析袋浸入蒸馏水中。经过一段时间，袋内的盐类浓度即逐渐降低。若经常更换袋外的液体，最后即可使袋内的蛋白质溶液中所

3、含的盐类除净，从而达到脱盐的目的。应用不同浓度硫酸铵分段盐析法将血清中γ–球蛋白及α、β球蛋白分离，最后用透析法脱盐，即可得到纯度较高的γ–球蛋白。【试剂和器材】一试剂1．pH7.2，0.01mol/L磷酸盐缓冲液生理盐水（简称PBS）：取0.2mol/LNa2HPO4溶液36.0ml，0.2mol/LNaH2PO4溶液14.0ml混合，加NaCl8.5克，用蒸馏水稀释至1000ml。0.2mol/LNa2HPO4溶液：取28.4gNa2HPO4或71.6gNa2HPO4·12H2O用蒸馏水溶解稀释至1000ml。0.2mol/LN

4、aH2PO4溶液：取24gNaH2PO4用蒸馏水溶解稀释至1000ml。2．pH7.2饱和硫酸铵溶液：取化学纯（NH4）2SO4800g，加蒸馏水1000ml，不断搅拌下加热至50～60℃，并保持数分钟，趁热过滤，滤液在室温中过夜，有结晶析出，即达到100％饱和度，使用时用浓氨水将饱和硫酸铵溶液调pH到7.2。3．纳氏试剂：纳氏试剂贮存液：于500ml三角烧瓶内加入碘化钾150克、碘110克、汞50克及蒸馏水l00ml，用力振荡7~15分钟，至碘色将转变时，此混合液即产生高热。随即将此烧瓶浸于冷水内振荡，直至棕色之碘转变成带绿色之碘

5、化钾汞溶液为止。将上清液倾入2000ml量筒内，并用蒸馏水洗涤瓶内沉淀物数次。将洗涤液一并倾入量筒内，加蒸馏水至2000ml刻度后，混匀即成。纳氏试剂应用液：取10%氢氧化钠700ml，钠氏试剂贮存液150ml及蒸馏水150ml混匀即成，如显混浊，可静置数日后取上清液使用。此试剂之酸碱度极为重要。用lmol/L盐酸溶液20ml滴定时，需此试剂11～11.5ml恰好使酚酞指示剂变成红色时最为适宜。否则必须纠正其酸碱度。4．双缩脲试剂：溶解1.50克硫酸铜（CuSO4·5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（NaKC4H406·4H20）于50

6、0ml蒸馏水中。在搅拌下加入10%氢氧化钠溶液300ml，用蒸馏水稀释到1升，贮存在内壁涂以石蜡的瓶中，可长期保存。5．浓蔗糖液：蔗糖的饱和溶液。6．10%氢氧化钠：取10克氢氧化钠溶解于蒸馏水中，定容至100ml。二器材1．透析袋。2．磁力搅拌器。3．离心机。三材料兔血清【操作】一盐析1．取离心管1支加入血清2ml，再加入等量PBS稀释血清，摇匀后，逐渐加入pH7.2饱和硫酸铵溶液2ml（相当于33%饱和度硫酸铵），边加边摇。然后静止半小时，再离心（3000r/min）20分钟，倾去上清液（主要含白蛋白）。2．用lmlPBS将离心

7、管底部的沉淀搅拌溶解，再逐滴加饱和硫酸铵溶液0.5m1。摇匀后放置半小时，离心（3000r/min）20分钟，倾去上清液（主要含α、β球蛋白），其沉淀即为初步纯化的γ–球蛋白。如要得到更纯的γ–球蛋白，可重复盐析过程1～2次。3．把提取的γ–球蛋白用1mlPBS悬浮。二透析脱盐与浓缩1．将盐析得到的γ–球蛋白放入透析袋内，用线绳缚紧上口，用玻璃棒悬在盛有半杯蒸馏水的100ml烧杯中，使透析袋下半部浸入水中。2．将烧杯放在磁力搅拌器上搅拌1小时以上（中间换水1～2次），然后将透析袋取下。小心将线绳解开，吸取袋内的液体，与烧怀中的水同时

8、用双缩脲试剂检查袋内外的蛋白质，用纳氏试剂检查袋内外液体中的铵离子（NH4+），观察透析法的脱盐效果。3．脱盐后得到的γ–球蛋白溶液可继续浓缩，即用透析袋装好悬于盛有10ml浓蔗糖或聚乙二醇溶液的小烧杯内1小时以上，观察袋内液体体积的