欢迎来到天天文库
浏览记录
ID:59378124
大小:151.50 KB
页数:23页
时间:2020-01-27
《动物生物化学实验讲义.doc》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、动物生物化学实验讲义东北农业大学动物生化教研室实验项目1γ–球蛋白的分离实验项目2γ–球蛋白含量测定(光度分析法)实验项目3凝胶柱层析法(γ–球蛋白纯化)实验项目4SDS–聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS–PAGE)实验项目5动物组织中DNA的制备实验项目6多聚酶链反应(PCR扩增反应)实验项目7琼脂糖凝胶电泳分离DNA实验项目8转氨酶GPT活性的测定实验项目9氨基酸薄层层析实验项目10琥珀酸脱氢酶及丙二酸的抑制作用实验一γ–球蛋白的分离【原理】中性盐(如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠、硫酸镁等)对球状蛋白质的溶解度有显著影响。随着中性盐浓度的增
2、加,离子强度也增加。当溶液离子强度增加到一定数值时,溶液中蛋白质的溶解度开始下降。离子强度增加到足够高时,蛋白质可从水溶液中沉淀出来,这种现象叫做盐析。各种蛋白质的溶解度不同,因而可利用不同浓度的高浓度盐溶液来沉淀分离各种蛋白质。蛋白质是一种生物大分子,它具有不能通过半透膜的性质。透析就是利用这种性质使之与其它小分子物质如无机盐、单糖等分开。本次实验应用的是脱盐透析,即盐析后,将含大量盐类的蛋白质溶液放在半透膜的袋内,再将透析袋浸入蒸馏水中。经过一段时间,袋内的盐类浓度即逐渐降低。若经常更换袋外的液体,最后即可使袋内的蛋白质溶液中所
3、含的盐类除净,从而达到脱盐的目的。应用不同浓度硫酸铵分段盐析法将血清中γ–球蛋白及α、β球蛋白分离,最后用透析法脱盐,即可得到纯度较高的γ–球蛋白。【试剂和器材】一试剂1.pH7.2,0.01mol/L磷酸盐缓冲液生理盐水(简称PBS):取0.2mol/LNa2HPO4溶液36.0ml,0.2mol/LNaH2PO4溶液14.0ml混合,加NaCl8.5克,用蒸馏水稀释至1000ml。0.2mol/LNa2HPO4溶液:取28.4gNa2HPO4或71.6gNa2HPO4·12H2O用蒸馏水溶解稀释至1000ml。0.2mol/LN
4、aH2PO4溶液:取24gNaH2PO4用蒸馏水溶解稀释至1000ml。2.pH7.2饱和硫酸铵溶液:取化学纯(NH4)2SO4800g,加蒸馏水1000ml,不断搅拌下加热至50~60℃,并保持数分钟,趁热过滤,滤液在室温中过夜,有结晶析出,即达到100%饱和度,使用时用浓氨水将饱和硫酸铵溶液调pH到7.2。3.纳氏试剂:纳氏试剂贮存液:于500ml三角烧瓶内加入碘化钾150克、碘110克、汞50克及蒸馏水l00ml,用力振荡7~15分钟,至碘色将转变时,此混合液即产生高热。随即将此烧瓶浸于冷水内振荡,直至棕色之碘转变成带绿色之碘
5、化钾汞溶液为止。将上清液倾入2000ml量筒内,并用蒸馏水洗涤瓶内沉淀物数次。将洗涤液一并倾入量筒内,加蒸馏水至2000ml刻度后,混匀即成。纳氏试剂应用液:取10%氢氧化钠700ml,钠氏试剂贮存液150ml及蒸馏水150ml混匀即成,如显混浊,可静置数日后取上清液使用。此试剂之酸碱度极为重要。用lmol/L盐酸溶液20ml滴定时,需此试剂11~11.5ml恰好使酚酞指示剂变成红色时最为适宜。否则必须纠正其酸碱度。4.双缩脲试剂:溶解1.50克硫酸铜(CuSO4·5H2O)和6.0克酒石酸钾钠(NaKC4H406·4H20)于50
6、0ml蒸馏水中。在搅拌下加入10%氢氧化钠溶液300ml,用蒸馏水稀释到1升,贮存在内壁涂以石蜡的瓶中,可长期保存。5.浓蔗糖液:蔗糖的饱和溶液。6.10%氢氧化钠:取10克氢氧化钠溶解于蒸馏水中,定容至100ml。二器材1.透析袋。2.磁力搅拌器。3.离心机。三材料兔血清【操作】一盐析1.取离心管1支加入血清2ml,再加入等量PBS稀释血清,摇匀后,逐渐加入pH7.2饱和硫酸铵溶液2ml(相当于33%饱和度硫酸铵),边加边摇。然后静止半小时,再离心(3000r/min)20分钟,倾去上清液(主要含白蛋白)。2.用lmlPBS将离心
7、管底部的沉淀搅拌溶解,再逐滴加饱和硫酸铵溶液0.5m1。摇匀后放置半小时,离心(3000r/min)20分钟,倾去上清液(主要含α、β球蛋白),其沉淀即为初步纯化的γ–球蛋白。如要得到更纯的γ–球蛋白,可重复盐析过程1~2次。3.把提取的γ–球蛋白用1mlPBS悬浮。二透析脱盐与浓缩1.将盐析得到的γ–球蛋白放入透析袋内,用线绳缚紧上口,用玻璃棒悬在盛有半杯蒸馏水的100ml烧杯中,使透析袋下半部浸入水中。2.将烧杯放在磁力搅拌器上搅拌1小时以上(中间换水1~2次),然后将透析袋取下。小心将线绳解开,吸取袋内的液体,与烧怀中的水同时
8、用双缩脲试剂检查袋内外的蛋白质,用纳氏试剂检查袋内外液体中的铵离子(NH4+),观察透析法的脱盐效果。3.脱盐后得到的γ–球蛋白溶液可继续浓缩,即用透析袋装好悬于盛有10ml浓蔗糖或聚乙二醇溶液的小烧杯内1小时以上,观察袋内液体体积的
此文档下载收益归作者所有