动物生物化学实验重点

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1、动物生物化学实验一、动物生物化学实验特点1．实验材料新鲜2．被测成分在动物组织、细胞中含量很少3．体外操作应尽量模拟生理环境条件4．在绝大多数条件下，生物分子是溶解在溶液中，很难直接看到所研究的内容二、注意事项1.工作服；严禁吸烟、饮水、进食；废液缸、冲稀、废物桶2.铬酸洗液；10%-20%尿素；硝酸3.恰当的吸管，减少误差三、离心机1．利用离心力把溶液中比重不同的固液分离。分为常速、高速和超速离心机。2．液体要加到三分之二左右、严格配平、不要超过最大转速、防止过热。四、酶活性的观察1酶：活细胞产生，对特异底物有高效催化能力的生物催化剂，化学本质多数蛋白质。影响酶活性：PH、

2、温度、激活剂和抑制剂激活剂、抑制剂：能（升高）降低酶的活性，但又不使酶失活的物质《对酶有选择性》（区别于酶的失活）2淀粉在唾液淀粉酶的催化下会水解，水解程度随时间的延长而增加。利用碘液指示水解程度：淀粉（蓝色）——糊精（深褐色、深红色）——麦芽糖、葡萄糖（棕黄色，碘液本身的颜色）337摄氏度、PH6.8（磷酸缓冲液中PH6.6）、激活剂0.5%NaCl、抑制剂1%CuSO44注意：温度对酶的影响中沸水浴后要冷却；酶反应的特异性检验中加斑氏试剂后沸水浴先砖红色沉淀；酶的活性通常是以测定酶作用的底物或产物在酶作用前后的变化来进行观察。五、琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察1琥

3、珀酸脱氢酶是三羧酸循环中的一个重要的酶，位于线粒体中，可使琥珀酸脱氢而生成延胡索酸。在缺氧的条件下，适当的受氢体也可接受脱氢酶从底物上脱下的氢。当甲烯蓝（蓝色）作为受氢体甲烯蓝被脱下的氢还原成甲稀白（无色物质）。【甲稀白易氧化用液体石蜡液封】2酶的竞争性抑制作用：丙二酸化学结构与琥珀酸相似，可与琥珀酸竞争性的结合琥珀酸脱氢酶的活性中心，若已与丙二酸结合，则不能再催化琥珀酸脱氢，此现象称为酶的竞争性抑制作用。解除酶的竞争性抑制作用：加大底物浓度的方法1研磨应充分；滴加试剂时，最后滴加心脏制备液。一、肝糖原的提取与鉴定1糖原微溶于水，无还原性，遇碘呈红色。提取时，肝中的蛋白质被三

4、氯乙酸沉淀，离心后弃沉淀，向上清液加入乙醇则肝糖原被沉淀，溶于水即可。2糖原遇HCl水解后生成葡萄糖，具有还原性，调节PH至中性后，可与斑氏试剂沸水浴生成砖红色沉淀。3注意：若处于饥饿状态，肝糖原含量会大量减少；肝脏离体后，肝糖原会迅速分解，需用三氯乙酸使相关酶失活；PH过高会影响（蓝色多？）二、血液葡萄糖的测定1葡萄糖醛基具有还原性，与碱性铜混合加热醛基被氧化成羧基，生成砖红色氧化亚铜。2氧化亚铜可使磷钼酸还原成钼蓝（蓝色）。蓝色的深浅与血滤液中的糖浓度成正比，通过与标准管比色，可求出测定管葡萄糖的含量。3福林吴宪氏法：福林-吴宪血糖管（用前不用刷洗，保持内壁干燥），管径在

5、4ml容量处缩小，可减少在煮沸时管内液体与空气的接触，以避免产生的氧化亚铜再氧化（降低实验结果）4分光光度计：公式：使用预热仪器20min；选定波长；调节透光度“0”点（开盖调“0”）闭盖调“100”，将空白溶液的比色皿加入第一格，blabla；测定吸光度；关机注意：防止光电管疲劳，不用时将比色皿暗箱盖打开；不准碰比色皿透光面，捏毛玻璃面；待测液润洗5注意：滴加磷钼酸后静置为放出CO2；在620nm处比色；沸水浴时准确加热8min；磷钼酸后显色不稳定，应迅速比色；血滤液内除葡萄糖外还含其他还原性物质,故测的结果较实际值偏高三、血清总蛋白及非蛋白氮的测定1总氮：所有含氮物质中氮

6、的总和；非蛋白氮：除蛋白质以外的含氮物质2非蛋白氮经强酸消化后转变为硫酸铵，加入奈氏试剂后呈现棕黄色，波长420nm处比色3钨酸是蛋白质沉淀剂4加入奈氏试剂后变浑浊：奈氏试剂酸碱度不够精准；消化时加热不足；显色后至比色时间过久；血滤液内非蛋白氮含量过高四、动物组织核酸的提取与鉴定1加入水饱和酚剧烈震荡，蛋白质在中层，取上清液加乙醇留沉淀溶于水。加硫酸沸水浴水解2现象：磷酸：加钼酸铵生成磷钼酸被氨基苯磺酸还原成钼蓝嘌呤碱：与硝酸银生成灰褐色絮状嘌呤银化合物核糖：与硫酸生成糠醛与3,5-二羟甲苯生成绿色化合物脱氧核糖：与二苯胺生成蓝色化合物一、聚丙烯酰胺凝胶电泳1聚丙烯酰胺凝胶由

7、单体丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺在催化剂过硫酸铵或核黄素和加速剂N,N,N’,N’-四甲基乙二胺作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。2光化学作用：核黄素化学聚合作用：过硫酸铵+TEMED（加速剂）3连续系统：一种浓度凝胶、一种PH和一种缓冲剂成分组成不连续系统：两种不同浓度凝胶组成体系4本实验是不连续系统由浓缩胶和分离胶组成。浓缩胶：位于上部、孔径大（无分子筛效应）、缓冲液PH6.7tris-hcl、浓缩作用分离胶：下部、孔径小、缓冲液PH8.9tris-HCL5不连续系统：电位梯度-三种