水的大肠菌群检测方法.doc

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1、4．1在2个装有50ml三倍浓缩乳糖胆盐培养液的大试管或烧杯内各加入水样100mL。4．2在10支装有5mL三倍浓缩乳糖胆盐培养液的试管里各加入水样10mL。4．3轻摇试管，使液体充分混匀，置36±1℃培养箱中，培养24h。4．4观察每管是否产气，如不产气则报告为大肠菌群阴性；若有气体产生则为推测性试验阳性，需做进一步的证实试验。5证实试验5．1平板分离自推测性检验阳性管中取一接种环培养液，接种到伊红美蓝琼脂平板上，置36±1℃培养箱培养18～24h，观察菌落形态，典型的大肠菌群菌落为黑紫色或红紫色，具有金属光泽。

2、5．2复发酵试验挑取可疑大肠菌群菌落1或2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，于36±1℃培养箱中，培养24h。5．3凡乳糖发酵管最终产酸产气，革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，为大肠菌群阳性。记下证实实验的阳性管数，查最大可能数（MPN）检索表得出1000mL水样中总大肠菌群的MPN值。总大肠菌群（MPN）检索表二、大肠菌群膜法测定1定义大肠菌群（coliformbacteria）为需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌，将带菌滤膜贴在含乳糖的选择性培养基上，经37℃培养24小时后，呈现深暗红色带金属光泽的菌落。2仪

3、器2．1滤器2．2滤膜，孔径0．45μm。直径根据滤器规格，目前常用的有35mm和27mm两种。2．3抽滤设备2．4无齿镊子2．5其它仪器见《GB/T××××－××公共场所茶具微生物检验方法，大肠菌群测定》中第3章。3培养基3．1品红亚硫酸钠培养基3．1．1成分：蛋白胨10g酵母浸膏5g牛肉膏5g乳糖10g琼脂10～20g磷酸氢二钾3．5g无水亚硫酸钠5g5％碱性品红乙醇溶液20mL蒸馏水1000mL3．1．2储备培养基的制备将磷酸氢二钾、酵母浸膏、牛肉膏及蛋白胨加到含有900mL蒸馏水的烧杯中，溶解后调pH值到7

4、．2～7．4，加入琼脂加热溶解，用蒸馏水补足至1000mL，趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，115℃高压灭菌20min，置冷暗处备用。3．1．3平皿培养基的制备将上述培养基加热融化，根据培养基的用量，碱性品红乙醇溶液与培养基按1∶50的比例，用灭菌吸管吸取一定量的碱性品红溶液置于灭菌空试管中。再按1∶200的比例称取所需的无水亚硫酸钠置于另一个灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解，在沸水浴中煮沸灭菌10min。用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液至深红色退成淡粉红色为

5、止。将此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加入已融化的储备培养基中，并充分混匀（防止产生气泡），立即将此种培养基适量倾入灭菌的空平皿内，待其冷却凝固后置冰箱内备用。此培养基于冰箱中保存不宜超过两周，如培养基已由淡红色变成深红色，则不能再用。3．2乳糖蛋白胨培养液见《游泳池中大肠菌群多管发酵测定法》4操作步骤4．1滤膜灭菌：将滤膜放入含蒸馏水的烧杯中，煮沸灭菌三次，每次15min。前两次煮沸后需更换水洗涤2～3次，以除去残留溶剂。4．2滤器灭菌：用121℃高压灭菌20min或用点燃的酒精棉球火焰灭菌。4．3水样过滤：用无

6、菌镊子夹灭菌滤膜边缘部分，将滤膜粗糙面向上，贴放在滤床上。固定好滤器，打开滤器阀门，在－0．5大气压下抽滤。4．4培养：水样滤完后，再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器。用灭菌镊子夹滤膜边缘部分，移放在乳糖琼脂分离培养基上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者之间不得留有气泡。然后将平皿倒置，放入36±1℃恒温箱内培养18～24h。4．5挑取滤膜上符合下列特征的菌落进行革兰氏染色、镜检。紫红色，具有金属光泽的菌落；深红色，不带或略带金属光泽的菌落；淡红色，中心色较深的菌落。4．6将革兰氏染色为阴性的无芽

7、胞杆菌接种到乳糖蛋白胨培养液中，于36±1℃培养48h。产酸产气者证实为大肠菌群阳性。5检验结果报告计算滤膜上生长的证实为大肠菌群的菌落数，再乘以10即为每1000mL水样中的大肠菌群数。