动物细胞工程制药ppt课件.ppt

《动物细胞工程制药ppt课件.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、动物细胞工程制药第五节动物细胞培养的基本方法一、细胞分离离心分离法：主要用于从含有细胞的体液如血液、羊水、胸腹水中分离细胞消化分离法：先从生物体取来组织块，将其剪碎，并用消化液将其消化，使组织松散成细胞悬液，然后用缓冲液洗涤、离心、去除残留的消化液而获得所需的细胞常用的消化物：胰蛋白酶（trypsin）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA）、或胰酶-柠檬酸盐、胰酶-EDTA联合使用、胶原酶（collagenase）、链霉蛋白酶（pronase）、木瓜蛋白酶（papain）等二、细胞计数自动

2、细胞计数器计数血球计数板计数结晶紫染色细胞核计数法MTT染色计数法细胞计数计数方法与微生物细胞的计数方法类似。通常以“细胞个数/mL”来表示。注意1.若细胞团数超过10%，则消化不充分；若细胞数少于20个/mm3或多于50个/mm3，说明稀释不当，都要重新操作。一般每个大方格中细胞数量以20~50个为宜。2.细胞密度低于104，则无法计数。3.细胞悬液密度计算公式：（个/ml）=四个计数室细胞之和/4×104MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法。显色剂四唑盐商品名是噻唑蓝，简称为MTT。该方法被广泛用于一些生物活性因子的活性检测，大

3、规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。特点是灵敏度高，重复性好，操作简便、经济、快速、易自动化，无放射性污染，与其他检测细胞活力的方法(如细胞计数法、台盼蓝染色法等)有良好的相关性。MTT法实验原理活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的紫色结晶物，因此，溶液的颜色深浅可间接反映活细胞数量。用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，代

4、表活细胞数量的多少。操作过程1.接种细胞：传代消化细胞以（103~104）浓度接种于96孔板，每孔200μL。2.培养细胞：37℃、5％CO2、饱和湿度下培养3～5天。3.呈色：第3～5天后，每孔加入MTT溶液(5mg／m1)20μL，37℃继续培养4h，终止培养。弃去上清液，每孔加入150μLDMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。4.比色：设不加细胞只加培养液的空白对照调零。490nm波长测定各孔光吸收值，记录。以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。一般来说，二倍体只能传40-50代，而异倍体细胞可无限制地进行传代悬浮细胞

5、的传代：加入一倍或几倍的生长液，然后分种两只或多只培养瓶即可贴壁细胞的传代：先消化再分种三、细胞传代四、细胞的冻存和复苏细胞的冻存：采用液氮低温（-196℃）冻存；加保护剂如5-20%甘油和5-12.5%二甲基亚枫（保护剂）；冷冻速度以1℃/min的速度下降为宜①将生长良好的细胞按传代方法消化，离心制成细胞压积后，用10%DMSO+20%血清+培养液，现配冷冻液0.6~0.8mL将细胞稀释制成细胞悬液，做好标记。②缓慢降温：大约每分钟1～3℃，至-20℃。与冰块放在一起，在4℃中10分钟，再放入-20℃20分钟。③快速降温：每分钟15～3

6、0℃至-196℃。将细胞直接投入液氮罐中，长期保存。细胞的复苏：快融一般采用快速融化法。从液氮罐-196℃温度下迅速取出细胞冷冻管，放到37℃水浴中，轻轻摇动试管，使内容物在20～60s内完全溶解，将冷冻细胞液吸出加入到20倍于冷冻液的培养液中，离心1~3次，去除冷冻液，制成细胞悬液，按一定的密度进行培养。五、细胞的常规检查细胞培养后，需要2~3天对细胞做常规检查，主要有：细胞的生长状态、pH、是否污染、活力等情况，随时掌握细胞的动态变化及时处理有关异常情况。1.细胞的生长状态主要经历四个阶段：游离期--刚接种细胞悬浮呈圆球形。吸附期--

7、细胞一般24h内逐渐贴附于培养皿底。繁殖期--对数生长期。直到长满皿底为止。退化期--由于接触和密度抑制，细胞停止生长，从皿底脱落。2.细胞的形态观察和活力测定形态生长良好的细胞，镜下观察：透明、轮廓清楚；若生长不好，则细胞折光性不匀，细胞间隙加大，形态不规则等。活力测定第六节动物细胞大量培养的方法和操作方式一、动物细胞大规模培养的方法悬浮培养（suspensionculture）贴壁培养（anchorage-dependentculture）贴壁-悬浮培养：微载体培养（microcarrierculture）、包埋和微囊培养和结团培养悬

8、浮培养悬浮培养：让细胞自由地悬浮于培养基内生长增殖优点：操作简便，培养条件比较均一，传质和传氧较好，容易扩大培养规模，在培养设备的设计和实际操作中可借鉴许多有关细菌发酵的经验缺点：细胞体积较小