《细胞工程制药复习》ppt课件

《《细胞工程制药复习》ppt课件》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、第四章细胞融合与单克隆抗体CellFusionandMonoclonalAntibodies细胞融合单克隆抗体技术第一节细胞融合一、细胞融合剂二、细胞融合方式三、细胞融合技术四、杂种细胞的筛选第一节细胞融合定义：指将不同来源的原生质体相融合，并使之分化再生、形成新物种或新品种的过程，又称为体细胞杂交第一节细胞融合原理：植物细胞->去细胞壁(酶消化)动物细胞->分散(酶消化)->单个原生质体->诱导融合->筛选关键：建立细胞桥一、细胞融合剂病毒类DNA病毒：水痘和疱疹病毒RNA病毒：仙台(HVj)病毒RNA致癌病毒：Rous肉瘤病

2、毒冠状病毒化合物水溶性：PEG、DMSO脂溶性：溶血卵磷脂生物制剂昆虫提取物受体作用电荷作用二、细胞融合方式完整细胞之间的融合核体、胞质体与完整细胞的融合作用微小细胞与完整细胞的融合脂质体介导的细胞融合三、细胞融合技术生物法（病毒诱导融合）化学法（化学剂诱导融合）物理法（电融合）生物法化学法：聚乙二醇（PEG）介导的细胞融合原理：①促使细胞凝结（负电荷作用）②破坏接触处细胞膜（被洗脱）影响因素：分子量：4000—6000浓度：20—60%（通常：30—50%）pH：偏碱为宜（pH7.4—8.0）其他：二甲亚砜、植物血凝素原理：

3、细胞在电场中极化成偶极子，并排列成串，然后用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜。物理法：细胞电融合甜菜原生质体电融合过程1）在高频电流电场下的相互接2）脉冲刺激后30s50秒后4）1.5分钟后5）6分钟后6）15分钟后，原生质体融合完成。注意事项1）介质要求高2）控制电压的强度和时间优点：融合率高融合率＝（融合组多核细胞的核数－对照组多核细胞的核数/对照组的全部细胞数）×100％可在显微镜下定向诱导细胞融合可直接挑选杂种细胞原理：两种亲本细胞融合混合物中可有多种类型细胞，筛选目的是获得优良杂种细胞。四、杂种细胞的筛选同核体异核体

4、多核体异胞质体核质体1植物细胞筛选方式1）遗传互补筛选法如亲本1：叶绿体缺陷型亲本2：光致死型融合细胞：正常2）抗性互补筛选法如：亲本1：放线菌素D＋，MS－亲本2：放线菌素D－，MS＋杂种细胞：放线菌素D＋，MS＋而亲本和其它细胞死亡3）利用物理特性筛选法亲本1：异硫氰酸荧光素（FITC）标记亲本2：碱性蕊香红荧光素标记荧光显微镜下，亲本1：绿色，亲本2：红色，杂种细胞可以区分4）利用生长特性筛选法如粉兰烟草与朗氏烟草细胞：外源激素融合细胞：内源激素动物细胞的筛选方式：1）利用抗药性筛选系统亲本A：Amp－，Kan＋亲本B：K

5、an－，Amp＋杂种细胞：Amp＋，Kan＋2）营养互补筛选系统亲本A：色氨酸缺陷型亲本B：苏氨酸缺陷型杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养，亲本细胞均死亡。3）温度敏感突变型亲本一：Kan＋，37度亲本二：高温敏感突变型，Kan－杂种细胞能在高温和含Kan培养基生长。第二节单克隆抗体一、抗体的结构与功能二、单克隆抗体的制备和生产三、单克隆抗体的改造和应用抗体是由B细胞受抗原刺激后所分泌的蛋白质。一、抗体的结构与功能二、单克隆抗体的制备杂交瘤技术：将能够产生抗体的B淋巴细胞和具有无限增殖力的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂

6、交瘤细胞。单克隆抗体(monoclonalantibody，简称McAb)：单一类型的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子。单抗的特点1.高度特异性2.高度稳定性3.高抗体活性4.不可知性5.过于单一性单抗的制备原理1.病毒转化2.细胞杂交单抗的制备过程1.动物免疫与亲本选择2.细胞融合3.杂交瘤细胞的筛选4.单抗制备和冻存5.单抗纯化1.动物免疫与亲本选择1）骨髓瘤细胞一般不分泌抗体能在体外无限繁殖和连续继代培养为HPRT－或TK－。多用BALB/C小鼠的骨髓瘤细胞。2）淋巴细胞免疫方法体内法体外法2.细胞融合脾细胞和骨髓细胞混

7、匀离心沉淀滴加50%的PEG0.5ml静置90秒滴加不含血清培液或BSS5－10ml静置10分钟3.HAT培养基筛选杂交瘤细胞细胞团块分散，加HAT溶液，稀释加入有饲细胞的多孔培养板2－3天半量换液，7天后完成细胞融合的选择示意图1）HAT选择系统HAT：是含一定浓度次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的一种选择性培养基，其中三种成分与细胞DNA合成有关。DNA合成途径有两种。原理：杂交瘤技术中，常选用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷（HPRT-）或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤细胞为亲本之一，无补救途径。

8、含氨基喋呤培养基抑制了全合成途径。淋巴细胞具有合成DNA的两条途径。杂种细胞通过互补作用获得HRPT或TK基因，可应用培养基中次黄嘌呤及胸腺嘧啶核苷，通过补救合成途径合成DNA。在HAT培养基中，HPRT-或TK-亲本细胞死亡，淋巴细胞亦逐渐死亡，只有杂种细胞存