西索米星论坛.doc

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1、一.内毒素和热原的概念1.热原：是指临床上引起哺乳动物发热反应的物质热原分为外源性和内源性热原。外源性热原主要由病原体产生，如：细菌、病毒、真菌、螺旋体、疟原虫等；内源性热原主要有白细胞介素-1（IL-1）白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNFa）和干扰素。这些物质已经证明在生物体发热过程中起重要作用。2.内毒素：是革兰氏细菌细胞壁的产物，是高分子量脂多糖复合物。是热原的一种。二.细菌内毒素检查的基础理论1.细菌内毒素1）化学成分及特性—革兰氏阴性细菌细胞壁的产物—是高分子量脂多糖复合物（LP

2、S）。单体分子量介于10000-20000道尔顿，典型地以100000-500000道尔顿的聚合体形式存在（1）特性致热性内毒素作用于人体细胞，使之释放内毒素热原，在刺激下丘脑体温调节中枢，引起发热反应耐热性需要在250°C干热30分钟才能彻底灭活分子极性多糖链有亲水性，脂肪链具有疏水性，在水中不均匀分布酸碱性与强酸强碱水解反应鲎反应性能与鲎试剂发生多级酶促反应，形成凝胶除上述性质外，还有许多其他的生物活性（2）化学结构—含有3个截然不同的区域O特异侧链核心多糖类脂A核心多糖和类脂A之间有KDO键相连，

3、类脂A是以脂化的葡萄糖胺二糖通过焦磷酸酯键组成的糖脂化合物。KDO键成分具有致热性。2）细菌内毒素与热原的关系—内毒素是热原的一种—医药工业接受的观点是，内毒素是目前医药工业中最普遍和最主要的外源性热原，控制内毒素污染就等于控制热原污染3）标准内毒素与环境内毒素—标准内毒素17.经人工精制并经生物效价测定的细菌内毒素，作为BET检查的参考品或对照品.标准内毒素分为内毒素标准参考品（RSE）和内毒素工作标准品（CSE）.CSE的效价必须用RSE来标化，目前CSE的效价有两种标示方法：固定效价法（中国）及浮

4、动效价法（国际）—环境内毒素.天然产生的内毒素，普遍存在于水、空气及各种原料中，成分除了脂多糖外还含有蛋白质、多糖和其它杂质，其两极活性不明显，致热性较弱。BET的对象是环境内毒素。4）标准内毒素溶液的制备中国药典2005版BET法要求，将细菌内毒素国家标准品用BET检查用水溶解后，需在漩涡混合器上混匀15分钟，以后每稀释一步均应在漩涡混合器上混匀30秒。具有两极活性的内毒素分子在水中呈现不均匀分布。2.鲎试剂1）鲎试剂的分类--根据鲎的种类分类：.美洲鲎试剂（LAL）.中国鲎试剂或东方鲎试剂（TAL）

5、--根据检查方法分类：.凝胶法鲎试剂.光度法鲎试剂--根据鲎试剂的反应特异性分类：.普通鲎试剂.特异性鲎试剂2）鲎试剂的规格-一般分单次试验试剂和多次试验试剂（也称大装量试剂）-把自身的包装容器作为反应试管的试剂属于单次试验试剂。在国内使用的0.1ml/支的鲎试剂就属于单次试验试剂。-.多次试验试剂有0.5、0.6、1.2ml/支等，使用时应先用等量的BET水复溶鲎试剂。3）鲎试剂的质量标准--灵敏度.定义：在细菌内毒素检查法规定的条件下，能使鲎试剂产生凝集的标准内毒素的最低浓度，单位为EU/ml..常

6、用鲎试剂的灵敏度-0.5EU/ml.、0.25EU/ml.、0.125EU/ml.、0.06EU/ml.、0.03EU/ml.17--自身凝集.部颁标准是鲎试剂的阴性对照在37℃4小时不产生凝集反应。--缓冲能力--干燥失重4）鲎试剂与内毒素的反应机理细菌内毒素(脂多糖LPS)C因子C因子B因子B因子凝固酶原凝固酶﹡注:□活化因子凝固原凝固蛋白3、BET用水-2005年版药典要求，凝胶法BET用水应为内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水；光度测定法的内毒素含量应小于0.005EU/ml。4、

7、BET程序1）验证实验-凝胶法.灵敏度复核实验.干扰实验-光度测定法.标准曲线可靠性实验.干扰试验2）检查法--凝胶法.凝胶限量试验.凝胶半定量试验--光度测定法-动态比浊法试验终点浊度法试验.动态法.终点法-动态显色法试验终点显色法试验5、2005年版中国药典细菌内毒素检查法1）综述部分17--细菌内毒素检查法的定义及BET方法学分类--内毒素标准品及检查用水--BET器具的要求--供试品溶液的要求--内毒素限值的确定--最大有效稀释倍数的计算2）实验部分（1）凝胶法--鲎试剂灵敏度复核试验--干扰试

8、验--检查法（a）.凝胶限量试验(b).凝胶半定量试验（2）光度测定法--标准曲线的可靠性试验--干扰试验--检查法6.相关参数的计算1）限值L的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：L=K/ML为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示。K为人每公斤体重每小时的最大内毒素剂量，以EU/（kg.h）表示，注射剂K=5EU/（kg.h），放射性药品注射剂K=2.5EU/（kg.h），鞘内