可溶性蛋白质含量测定教学内容.doc

《可溶性蛋白质含量测定教学内容.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白质含量一、原理考马斯亮蓝G-250（CoomassiebrilliantblueG-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。该染料在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm在一定蛋白质浓度范围内（1-1000µg），蛋白质与色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。考马斯亮蓝G-250于蛋白质结合反应十分迅速，2min左右即达到平衡。其结合物在室温下1h内保持稳

2、定。此法灵敏度高，易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。二、材料、仪器设备及试剂1、材料：小麦叶片、马铃薯块茎、或其他植物材料2、仪器设备：分光光度计、研钵、烧杯、移液管3、试剂（1）标准蛋白质溶液：100µg·ml-1牛血清白蛋白：称取牛血清白蛋白25mg，加水溶解并定容至100ml,吸取上述溶液40ml，用蒸馏水稀释至100ml即可。（2）考马斯亮蓝G-250溶液：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml

3、90%乙醇中，加入100ml85%（W/V）的磷酸，再用蒸馏水定容到1L，贮于棕色瓶中，常温下可保存一个月。三、实验方法及步骤1、标准曲线的绘制取6支具塞试管，按表加入试剂。混合均匀后，向各管中加入5ml考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，并放置5min左右，在595nm下比色测定吸光度。以蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。管号123456标准蛋白质（ml）00.20.40.60.81.0蒸馏水量（ml）1.00.80.60.40.20蛋白质含量（µg）020406080100图1蛋白质

4、质量数与吸光度值线性关系图（雷恩，2016）2、样品测定（1）样品提取：氨基酸含量测试结束后，剩余的样品提取液可以作为该实验的样品提取液，如果没有上述提取液，则按照下面的方法进行提取。取鲜样0.5g，加入2ml蒸馏水研磨，磨成匀浆后用6ml蒸馏水冲洗研钵，洗涤液收集在同一离心管中，在4000r/min下离心10min，弃去沉淀，上清液转入容量瓶，以蒸馏水定容至10ml，摇匀后待测。（2）吸取样品提取液0.1ml，放入具塞试管中（每个样品重复2次），加入5ml考马斯亮蓝G-250溶液，充分混合，放置2

5、min后在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。（3）结果计算（单位mg/g）样品中蛋白质含量=（C·VT）/（1000·VS·WF）式中：C—查的标准曲线值（µg）VT—提取液总体积（ml）WF—样品鲜重（g）VS—测定时加样量（ml）教师课堂管理的30个经典细节1、第一印象很重要第一节课,如果开头的一段话热情洋溢；板书的第一个字让学生为之赞叹；第一次朗读让学生为之感动；用丰富的表情和机灵的眼神吸引住学生；得体的幽默让孩子笑起来；充满爱意的一次抚摸让学生感到亲切；教学方法的变

6、化让学生感到有趣，那么，你就成功了。如果这样，而且今后也不懈怠，我敢说，你绝对成功了。（著名特级教师于永正）教师的第一节课，应该是拉近和学生的距离,培养学生对这门学科的兴趣,学生的兴趣有了，教师以后的教学就会顺畅些、圆满些。2、用心记住每一个学生的名字直呼其名相对于不指名道姓课堂效果会更好，把所授班级的学生座次表写出来，上课时放在讲桌上，这样做，有助于记住学生的名字，尽快地了解每个学生。(著名特级教师于永正)教师上课时能熟记并且随时叫出学生的名字，学生就会感到获得了尊重，自然对教师产生了信任感、亲切

7、感，这种情况下的教学效果往往会很好。3、提前三分钟进教室