实验28-植物体内可溶性蛋白质含量的测定.doc

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1、实验28植物体内可溶性蛋白质含量的测定植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。在研究每一种酶的作用时，常以比活（酶活力单位／mg蛋白）表示酶活力大小及酶制剂纯度。因此，测定植物体内可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项目。常用测定方法有Lowry法和考马斯亮蓝G-250染料结合法。本实验将分别介绍这两种方法。一、考马斯亮蓝法【原理】考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内（0～100μg/

2、ml），蛋白质－色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。【仪器与用具】分光光度计，10ml量筒1支；研体；10ml容量瓶1支；1ml刻度吸管3支；10ml具塞刻度试管14支。【试剂】（1）牛血清白蛋白配成1000μg/ml和100μg/ml；（2）考马斯亮蓝G-250：称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml90%乙醇中，加入85%（W/V）磷酸100ml，最后用

3、蒸馏水定容至1000ml。此溶液在常温下可放置一个月；（3）90%乙醇；（4）磷酸（85%，W/V）。【方法】1.标准曲线的绘制（1）0～100μg/ml标准曲线的制作取6支试管，按表28-1数据配制0～100μg/ml血清白蛋白液各1ml。准确吸取所配各管溶液0.1ml，分别放入10ml具塞试管中，加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，反转混合数次，放置2min后，在595nm下比色，绘制标准曲线。表28-1配制0～100μg/ml血清白蛋白液管号123456100μg/ml牛血清蛋白量(ml)蒸馏水量(ml)蛋白质含量(mg)01.000.20.80.020.40.60.040.60

4、.40.060.80.20.081.000.10 （2）0～1000μg/ml标准曲线的制作另取6支试管，按表28-2数据配制0～1000μg/ml牛血清白蛋白溶液各1ml。与步骤（1）操作相同，绘出0～1000μg/ml的标准曲线。 表28-2配制0～1000μg/ml血清蛋白血液管号7891011121000μg/ml牛血清白蛋白（ml）蒸馏水量(ml)蛋白质含量(mg)01.000.20.80.20.40.60.40.60.40.60.80.20.81.001.02.样品提取液中蛋白质浓度的测定吸取样品提取液0.1ml（样品提取见各酶活测定），放入具塞刻度试管中（设两个重复管），加入5

5、ml考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2min后在595nm下比色，记录吸光度值，通过标准曲线查得蛋白质含量。3.结果计算样品蛋白质含量（mg/g鲜重）=式中C－查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg）；V－提取液总体积（ml）；a－测定所取提取液体积（ml）；W－取样量（g）。二、LOWRY法【原理】Lowry法是双缩脲法和福林酚法的结合与发展，其原理是：蛋白质溶液用碱性铜溶液处理，形成铜-蛋白质的络合盐，再加入酚试剂后，除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键、碱性铜的显色效果更强烈。因此，Lowry法的显色效果比单独使用酚试剂强烈3～15倍，为双缩脲法100倍。

6、由于肽键显色效果增强，从而减小了因蛋白质种类引起的偏差。Lowry法的试剂由两部分组成，试剂甲相当于双缩脲试剂（碱性铜溶液），可与蛋白质中的肽键起显色反应；试剂乙为磷钨酸和磷钼酸混合液，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原生成钼蓝和钨蓝混合物而呈蓝色反应，因此蛋白质的酪氨酸和胱氨酸等可显色，颜色深浅与蛋白质含量成正比。