可溶性蛋白质含量的测定.doc

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1、可溶性蛋白质含量的测定考马斯亮蓝G—250染色法一．原理考马斯亮蓝G—250染色法是利用蛋白质与染料结合的原理，定量地测量蛋白质浓度的快速灵敏的方法。考马斯亮蓝G—250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德瓦尔键结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律。此染料与蛋白质结合后颜色由红色转变成蓝色，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h之后，蛋白质—染料复合物发生聚合并沉淀出来。此法灵敏度

2、高（比Lowry法灵敏4倍）易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。其缺点是在蛋白质很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。二．实验材料、试剂与仪器设备1．实验材料水稻不同萌发时期的种子2.试剂（1）标准蛋白质溶液（100μg/mL牛血清白蛋白）。称取牛血清白蛋白25mg，加水溶解并定容至100mL,吸取上述溶液40Ml,用蒸馏水稀释至100mL即可。（2）考马斯亮蓝试剂。称取100mg考马斯亮蓝G—250，溶于50mL90%乙醇中，加入100mL85%的磷酸，再用蒸馏水定容到1000mL，贮于棕色瓶中。常温下可保存一个月。3.仪器和设备分光

3、光度计，离心机，研钵，烧杯，量瓶，移液管，试管等。三．实验步骤1.标准曲线的绘制取6支试管，按下表加入试剂，摇匀，向各管中加入5mL考马斯亮蓝试剂，摇匀，并放置5min左右，以0号试管为空白对照，在595nm下比色测定吸光度。以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。2.样品测定（1）样品提取。称取鲜样0.25—0.5g，用5mL蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，3000r/min离心10min，上清液备用。（2）吸取样品提取液1.0mL（视蛋白质含量适当稀释），放入试管中（每个样品重复2次），加入5mL考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置2min后在595nm下比色，

4、测定吸光度，并通过标准曲线查的蛋白质的含量。试剂0号管1号管2号管3号管4号管5号管标准蛋白质体积/mL00.200.400.600.801.00蒸馏水体积/mL1.000.800.600.400.200蛋白质含量/ug020406080100四．结果计算样品蛋白质的含量=CV／1000VW(mg／g)式中：C—查标准曲线值，ug；VT—提取液总体积，mL；WF—样品鲜重，g；VS—测定时加样量，mL