FRAP法测定Vc抗氧化能力.doc

《FRAP法测定Vc抗氧化能力.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、使用说明：1.FRAP工作液的配制：(1)参考下表，根据待测定样品的数量(含标准曲线)配制适量的FRAP工作液：1个检测5个检测10个检测20个检测50个检测TPTZ稀释液150μl750μl1500μl3000μl7500μlTPTZ溶液15μl75μl150μl300μl750μl充分混匀后再加入检测缓冲液检测缓冲液15μl75μl150μl300μl750μlFRAP工作液180μl900μl1800μl3600μl9000μlFRAP工作液配制后37℃孵育，并宜在1-2小时内使用完毕。2.待测样品的准备：(1)血清、血浆、唾液或尿液样品的准备：血清、血浆、唾液或尿液样品每个样品需

2、要5微升，都可以直接用于测定。血清、血浆、唾液或尿液样品都可以使用新鲜样品进行测定，也可以-80℃冻存后再进行测定。-80℃冻存的样品至少在一个月内所测定获得的数据没有显著变化。注意：血浆制备时可以使用肝素或柠檬酸钠抗凝，不宜使用EDTA抗凝。根据文献报道，人血清或血浆中的总抗氧化能力为0.5-2mM，人唾液中的总抗氧化能力为0.3-1mM，人尿液中的总抗氧化能力为0.2-3mM。(2)细胞或组织样品的准备：对于细胞样品，收集约100万个细胞(不必精确计数，直接刮下，不宜使用胰酶和EDTA消化)，放置在200微升冰冷的PBS或HBSS溶液中，匀浆或超声以充分破碎细胞并释放其中的抗氧化物，

3、4℃约12000g离心5分钟，取上清用于后续测定。对于组织样品，每20mg组织加入100微升冰冷的PBS或HBSS溶液，匀浆或超声以充分破碎组织并释放其中的抗氧化物，4℃约12000g离心5分钟，取上清用于后续测定。以上所有操作均需在4℃或冰上操作。制备好的细胞或组织样品的上清如果不立即用于测定，可以在-80℃冻存。-80℃冻存的样品至少在一个月内所测定获得的数据没有显著变化。细胞或组织样品在测定总抗氧化能力时需同时测定蛋白浓度，最后测定获得的总抗氧化能力通常表示为每毫克或每克蛋白重量中的总抗氧化能力，表示单位为mmol/mg或mmol/g。(3)其它样品的准备：植物或中草药抽提液都可以

4、直接用于检测。需注意样品本身的颜色不会干扰检测。植物或中草药抽提液的抗氧化能力可以表示为每毫克或每克抽提物干重中的总抗氧化能力，表示单位为mmol/mg或mmol/g。各种抗氧化物测定其抗氧化能力时，通常配制成0.15-1.5mM，然后进行测定。抗氧化物的浓度可以以摩尔浓度表示时，测定获得的总抗氧化能力可以用相对总抗氧化能力进行表示，例如0.5mM的某抗氧化物其测定获得的OD值和1mM的亚铁盐测定获得的OD值相同，则其相对总抗氧化能力为2，再如0.2mM的某抗氧化物其测定获得的OD值和1mM的亚铁盐测定获得的OD值相同，则其相对总抗氧化能力为5。3.标准曲线测定的准备：称取27.8mg本

5、试剂盒提供的FeSO4•7H2O，溶解并定容到1ml，此时浓度即为100mM。取适量100mMFeSO4溶液稀释至0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5mM。通常可以使用蒸馏水或样品配制溶液配制标准品。对于血清、血浆、唾液或尿液样品推荐直接用蒸馏水或PBS配制标准品；对于细胞或组织样品，推荐用用于细胞或组织匀浆的溶液配制标准品，其它样品参考前述方法进行。FeSO4溶液宜新鲜配制使用。100mMFeSO4溶液容易氧化产生三价铁盐，使溶液的颜色从最初的淡绿色逐渐转变为浅黄色。如果发现溶液的颜色已经呈现明显的黄色，应该弃用该溶液，并使用试剂盒提供的FeSO4•7H2O重新配制新鲜的F

6、eSO4溶液。4.总抗氧化能力的测定：(1)96孔板的每个检测孔中加入180微升FRAP工作液。(2)空白对照孔中加入5微升蒸馏水或PBS等适当溶液；标准曲线检测孔内加入5微升各种浓度的FeSO4标准溶液；样品检测孔内加入5微升各种样品或0.15-1.5mM的Trolox作为阳性对照。轻轻混匀。(3)37℃孵育3-5分钟后测定A593。如果测定A593有困难，也可以在585-605nm范围内进行测定。(4)根据标准曲线计算出样品的总抗氧化能力。如果样品测定出来的吸光度在标准曲线范围以外，需把样品适当稀释后再进行测定。(5)总抗氧化能力的表示方式：对于FRAP方法，总抗氧化能力用FeSO4

7、标准溶液的浓度来表示。例如某血浆样品测定获得的吸光度和1mMFeSO4标准溶液的吸光度相同，则该血浆样品的总抗氧化能力即为1mM；再如某血清样品测定获得的吸光度和0.65mMFeSO4标准溶液相同，则该血清样品的总抗氧化能力为0.65mM；再如某细胞匀浆液测定获得的吸光度和0.3mMFeSO4标准溶液相同，并且该匀浆液的蛋白浓度为0.15mg/ml，则该细胞样品的总抗氧化能力为0.3mM/0.15mg/ml，即2mmol/g；再如0