动物细胞培养预习报告-1-配液.doc

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1、预习报告—第8组胰液和培养液的配制与分装实验器材器材：血清瓶(5ml,10ml,50ml)青霉素瓶，注射器，抽滤器，烧杯，离心管（50ml,100ml,150ml）玻璃棒，磁力搅拌仪，冰箱，镊子，针栓，酒精，酒精棉，纱布，棉绳，牛皮纸，胶头吸管，小磁棒，湿膜，超净工作台，废液缸，电热恒温箱，电热干燥箱，打火机溶液：过氧乙酸，酒精，胰酶50ml，RPMIml，胎牛血清100ml，Hanks液50ml，TE(胰酶细胞消化液)，去离子水实验步骤一、无菌室准备1、实验环境无菌处理：（1）无菌室消毒：定期清洁，用过氧乙酸熏蒸，紫外线消毒1小时。（2

2、）超净台消毒。（3）实验者准备：紫外灯关闭30min钟后，实验者在缓冲区内穿白大褂，戴口罩，帽子，洗手，泡手，（穿隔离衣），酒精擦手，拿好实验物品进入无菌室（洗手后手不要再碰缓冲区内其他物品，开门由未完成准备的同学帮忙）。（4）台面准备：取出培养用品，酒精消毒瓶口瓶外壁，入台。抬起操作台隔板（不要抬太高，低于实验员坐位时的头部高度）。台面消毒（用浸过酒精的纱布把台面擦一遍）。酒精灯点火。镊子在外焰灼烧灭菌后放入酒精瓶。将台面的常用物品摆在便于操作的地方（如酒精灯在左手边，酒精棉球镊子瓶在右手边，废液瓶位于两瓶中间稍远的位置）。准备工作完成

3、。2、无菌技术要领：（1）手指不可触及器材使用端；（2）器材使用端经火焰消毒使用；（3）打开或封闭瓶口，安装吸管等都必须在无菌区进行；（4）开口瓶必须顺风45°斜放，用后及时关闭。3.、实验器材无菌使用：（1）血清瓶取用：右手持镊子过火，左手打开容器（不要放下盖子），镊子掀开纱布，取出血清瓶置于台面，镊子过火，扯回纱布，盖好盖子，镊子过火，放回酒精瓶。血清瓶使用之前，瓶盖放在酒精棉球上，瓶口灼烧灭菌后使用。（2）滤器使用：①取滤器时手不要碰到滤器宽口使用端，需要保持无菌，而且滤器不能烧灼灭菌处理；②滤器到手时是高压灭菌过的，没有拧紧，要拧

4、紧后再进行使用；③正常滤过时，液体是一滴一滴的下落，如果太快则可能滤膜破损，而且手推注射器的力度不要太大，不然容易损伤滤膜。（2）吸管使用：左手持筒，右手取下筒口包装，倒置于安全区内桌面。消毒筒口，左手抖动至吸管长处筒口，右手取管，左手消毒筒口，右手取筒口包装重新套于筒口，将吸管筒放置于远处。此过程中，右手吸管保持管口斜向外上，减小污染几率。吸管吸出液体不要太多，移液时要注意吸管口要保留一段空气柱。移液时吸管不要伸到瓶里放液，而是瓶口微斜，在瓶口外放液。二、超净台操作1、胰酶的过滤分装（实验员：甲：李以宁；乙：阿丽耶；丙：李梦洁）（1）从

5、材料框中取出配好的胰酶溶液，血清瓶，滤器，注射器等，放于台面安全区。（2）用镊子取5ml的血清瓶：左手持瓶，右手取下瓶口包装置于一边，火焰消毒瓶口后放于安全区内，取过滤器，拧紧，放于血清瓶口上；（瓶盖：取下的血清瓶瓶盖要口向下放在一团酒精棉球上）（滤器：取滤器时手不要碰到滤器宽口使用端，需要保持无菌，不能烧灼灭菌处理）。（1）注射器取液：将针头插入胰酶溶液内，左手持针筒，右手提针栓，缓慢吸出液体，排出空气。（2）注射器与滤器链接：注意左手扶瓶，防止倾倒，注射器内不能留有气泡。（3）过滤：左手扶瓶，右手持注射器缓慢加压，等到瓶内液体达5ml

6、刻度线时，取下注射器，取空血清瓶一支，灼烧瓶口灭菌处理。取下过滤器，检查滤膜，完好，放入空血清瓶。给分装好的血清瓶加塞，加膜（分装完成的瓶子放置在边台上，不要放在手边容易碰到）。（4）新5ml血清瓶，重复（2）至（5），共过滤分装10瓶，1-3瓶由甲同学进行操作，4-6瓶由乙同学进行操作，7-10瓶由丙同学操作。（5）全部进行完毕，用过的实验器材（滤器，胰酶溶液，注射器等放入超净台外器材框中待处理）2、培养液的配制（1）取分装有90mlRPMI1640的100ml血清瓶，在安全区内去塞（同1.（1））瓶塞侧立于酒精棉球之上，消毒瓶口，放于

7、安全区内（2）取分装有10ml血清的血清瓶，在安全区内去塞（同1.（1））瓶塞侧立于酒精棉球之上，消毒瓶口，放于安全区内（3）取吸管：左手持筒，右手取下筒口包装，倒置于安全区内桌面。消毒筒口，左手抖动至吸管长处筒口，右手取管，左手消毒筒口，右手取筒口包装重新套于筒口。此过程中，右手吸管保持管口斜向外上。（4）管加吸头，火焰消毒三次后，将10ml血清移入装有90mlRPMI1640的100ml血清瓶内，摇晃混匀，放在超净台上。3、培养液的分装（1）取50ml的血清瓶：左手持瓶，右手取下瓶口包装置于一边，火焰消毒瓶口后放于安全区内，准备吸管。

8、（2）吸管移液，一次转移的液体量不要过多，放液时注意不要伸到瓶里去。等到瓶内液体达50ml刻度线时，取下吸头，吸管放入器材筐。给血清瓶加塞，加膜。以上操作由甲同学完成。（6）取新10ml血清瓶