动物细胞培养(精).doc

《动物细胞培养(精).doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、动物细胞培养基本技术细胞培养（cellculture）是指从机体内取岀某种组织或细胞，模拟机体内的生理条件使其在体外生存、生长和繁殖的过程。细胞的体外培养在细胞生物学和医学研究领域有着极为广泛的用途，这一技术已成为研究细胞生理、细胞增游、细胞遗传、细胞癌变和细胞工程等课题的一项不可缺少的手段。细胞培养技术的突出优点在于能为研究者提供人量的生物性状相同的细胞作为研究对象，便于人们在体外利用各种不同的方法从不同的角度研究细胞生命活动的规律。另外，利用细胞培养技术还可使人们较为方便地研究各种物理、化学和生物因索对细胞结构和功能的影响。原代培养：指将要培养的动物细胞

2、取出后，先用烦蛋口酶等使组织分散成单个细胞，然后配制成一定浓度的细胞悬浮液，再将该悬浮液放入培养瓶中培养。传代培养：将原代细胞从培养瓶屮取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶屮继续培养，称为传彳弋培养。：IF•贴壁依赖性（非贴附型）细胞:来源于血液、淋巴组织的细胞，许多肿瘤细胞（包括杂交瘤细胞）和某些转化细胞等，这类细胞体外生长不必贴壁，可在培养液屮悬浮生长；贴華依赖性（贴附型）细胞:人多数动物细胞，都属于这一类型。它们需要附着于适当的固体或半同体表面上生长。HSRiR44(«■»)Hwmftas40ffieRwum*BF7rSWwrrnrbU

3、L处大竟亡(4UUK)第1节原代培^（Primaryculture;初始培养/原始培养/初代培养）直接山机体取得材料（细胞，组织或器官）培养到第一次传代前即为初始培养或原代培养。经初始培养后的细胞将形成“细胞系”O原代细胞培养一般步骤：■从健康动物体屮取出组织块■-＞剪碎■T用浓度、活性适宜的胰酶、胶原纤维酶或EDTA等消化或物理方法将细胞分散■T在合适的营养液和环境屮进行体外培养。1取材■过程一般在无菌条件下进行。2解离释放细胞■1）用剪刀和铁了等细心剖取组织和器官，加以修整，必要时切成小块；■2）借助酶、螯合剂或物理方法等处理组织，使其成为分散的细胞。■

4、体液和渗岀液中的细胞，则采川离心等方法收集或浓缩。2.1消化法/消化分散法■2.1.1胰蛋白酶解离细胞法■应用广泛。作用于和赖氨酸或粘氨酸相连接的肽键。适于消化细胞间质较少的软组织和传代细胞。C0和Mg?+对胰蛋白酶活力有一定抑制作用。血清可抑制烦蛋白酶活性。■消化酶的浓度和消化时间与pH、温度、组织块人小、组织的硕度和唳蛋白酶活力等都有关系。使用消化液的量常为被消化物的5〜10倍。1）胰蛋白酶处理方法：■热胰蛋白酶处理法（36.5°C）:冷胰蛋白酶处理法（4°C）冷眺蛋白酶法可获得较多的细胞量和较多的不同的细胞类型；而热肌蛋白酶法得不到类似结果,但所需时间

5、较短。2.1.2胶原酶解离细胞法由芽砲杆菌等细菌中捉取，对胶原成分冇强烈的消化作用。不同來源的胶原酚对不同类型胶原的水解作用强弱不等。该酶在C0和Mg"存在下仍有活性，血清亦不易使其失去活性。和胰蛋白酶混合应用时效果共好。适用于消化结缔组织和癌组织等。操作：■剪碎组织块放入生长培养液内，加入胶原酶（最终浓度200U/mL）■36.5°C温育J4〜48h,或更多■I轻度震动■静止使细胞集团自然沉降■上悬液■J■离心除去胶原酶液■J■细胞沉淀悬于培养液屮■I■接种培养■（成纤维细胞）2.1.3其他酶沉渣重悬于生理盐水内，任其自然沉降洗涤第一次自然沉降去掉未解离的

6、小组织块再重悬后得到的沉淀物为细胞小集团悬于培养液内接种培养（上皮样细胞）链霉蛋白酶：消化范围较广，且不受血清影响n但不适用于消化传代细胞。粘蛋白酶蜗牛酶胶原酶和透明质酸酶协同作用有助于分离人鼠或兔的肝脏。2.1.4螯合剂解离细胞法曾被采用的有柠檬酸钠、EDTA钠（versine）等。常用不含Ca"和Mg，十的缓冲剂配成0.02%的工作EDTA的作用比朕蛋白酶缓和，单独消化新鲜组织时少用。EDTA最适用于消化传代细胞，消化5~IOmin后，用缓冲液洗2~3次，加入培养液，用吸管从瓶壁上把细胞吹打下來，制成悬液，进行培养。EDTA不受血清抑制，消化后需彻底漂洗

7、.2.2机械解离细胞法软组织和间质成分少的肿瘤等适合用此法分散。一般比酶法快，但细胞存活率较低。%1针蕊挤压过网法（过筛法；挤压过筛法）%1针头抽吸法■软组织块T修剪、漂洗，反复剪切■I■加BSS液或基础培养液■J■用吸管反复吹打混匀■J■静置■/■收集对通过4号针头的单细胞悬液■J■细胞计数■J■接种培养3常用原代培养方法3.1夕卜植块（explant）培养/组织块培养法将组织剪成小块，直接放入培养皿/瓶屮，贴附一段时间后，经一段培养过程，细胞从组织块长岀，最终形成单层细胞。该方法简便，适于真皮细胞，骨骼肌细胞等和胚胎来源细胞的原代培养。3.2单层细胞培养

8、法/贴壁培养■细胞悬液■J■计数■J■接种■J■水平