动物细胞培养.doc

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1、重庆大学研究生专业实验教学实验报告书动物细胞培养技术实验课程名称:实验指导教师:学院：专业及类别：学号：姓名：实验日期：成绩：唐丽灵生物工程学院生物学（学术）20121902035冯京2013年5月重庆大学研究牛院制动物细胞培养技术一、实验目的1、掌握动物细胞传代培养的基本操作步骤；2、认知不同细胞的细胞形态及特征。二、实验仪器设备倒置显微镜、超净工作台、细胞培养箱、吸管、酒精灯、锻子、PBS、0.25%胰酶、培养基、胎牛血清、G2细胞株、C2C12细胞株、3T3细胞株。三、实验原理从生物体屮取出某种组织或细胞，模拟体内生理条件，在人工培养条件下使其生存、生

2、长、繁殖或传代，这一过程称为细胞培养。细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接观察活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因索，还可以与体内实验互为补充，可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象,耗费少，比较经济，因此成为生物学研究的重耍手段。细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需耍做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或儿个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。细胞培养是一种程序复

3、朵、耍求条件多而严格的实验性工作。所有离体细胞的生长都受温度、渗透压、pH值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规范和要求，特别是无菌操作是细胞培养成败的关键。U!(-)：观察C2C12细胞株、G2细胞株、3T3细胞株的形态特征。C2C12细胞株：成肌细胞是骨骼肌的前体细胞，是一种正常情况下位于成熟肌纤维表面的肌源性细胞，具有很强的增殖和分化能力。小鼠成肌细胞系C2C12细胞由Yaffe等［［83］克隆建立，体外培养的C2C12细胞能在低血清诱导条件下分化为多核的肌管，并表达myosin和myogenin等成熟骨骼肌的各种标志蛋白。因此，C2C12细胞通常成

4、为体外研究成肌细胞增殖和分化的首选模型。C2C12细胞的生长特性：相差倒置显微镜下，刚传代的C2C12细胞呈球形或椭圆形，有折光性,30min后升始贴壁，8h后贴壁完全。贴壁后的C2C12细胞呈梭形，单核，位于细胞中央。起始4.0xl04T个细胞接种于直径为35mm的细胞培养皿，3d后达80%左右汇合，4d后几乎占据培养11J1所有细胞生长表面，继续培养则相邻细胞变长并相互融合，肌小管形成增多。(80%)待细胞在完全生长培养液(DMEM/10%FBS/S/P)生长至80%左右汇合时，换成分化培养液(DMEM/2%HSISJP)后，大量细胞开始融合成肌管,分化

5、培养3d后，肌管大量形成，之后肌管进一步增长增粗。G2细胞株：HepG2细胞，来源于一个15岁白人的肝癌组织。该细胞分泌多种血浆蛋白，该细胞能大容量培养，乙肝表面抗原阴性，对G418有抗性，对人生长激素有刺激反应。HepG2生长状态是：堆积生长，单个细胞形态不明显，细胞贴舉性不牢固，不表达HBV,消化时间相对于普通的上皮细胞稍长，很难制备单细胞悬液。ATCCNumber:HB・8065Designotion:HepG23T3细胞株：指G・J.Todaro等从Swiss系小鼠胎儿里得到的细胞株。由于它显示出强烈的接触抑制作用，所以能明确地识别已发生转化的细胞，

6、并作为一种重耍的细胞材料使用于由肿瘤病毒和致癌剂等所引起的体外致癌研究。这一细胞系是将3x10细胞（第二个“3”）接种在底部而积为20平方厘米的培养是因为鼠纤维原细胞每3（第一个“3T天传代（gnsfeiTT—次，并进行连续培养的方法而建立的。3T3这一名称便由此而得。同样，由6x10细胞或12x10细胞进行接种而得的细胞株，分别称为3T6和3T12,这些细胞的接触抑制作用很弱。此外，在与3T3同一类的细胞中,有来自Balb/C系小鼠的Balb3T3细胞。成骨细胞是骨发生和骨形成的重要细胞，有别于其他类型的细胞的生物学特征。在倒置显微镜下观察.成骨细胞呈梭形

7、、三角形或星形，并伸出数量不等、长短不一的突起。并依旧保留细胞成骨呈集落生长趋势。成骨细胞的鉴别主耍依靠成骨细胞的特异性分泌蛋白，如碱性磷酸酶、骨钙素和II型胶原蛋口等及体外矿化的功能特征。碱性磷酸酶活性被认为是成骨细胞的一个重要生物学标志。ATCCNumber:CL-173Designation:3T3-L1LowDensityscaleBara100pmHighDensityScaleBar=100pm（二）细胞传代培养1、将长满细胞的培养板屮原来的培养液吸去；2、用3ml左右的PBS冲洗两遍；3、加入1〜2ml0・25%胰酶溶液，使板底细胞都浸入溶液中

8、；4、立即吸去大部分胰酶，然后放入培养箱中消化儿分钟