资源描述：
《动物细胞培养原理.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、2.2.2.2饲养细胞制备在杂交瘤细胞的培养过程屮，融合后大量骨髓瘤细胞和脾细胞在HAT培养液屮和继死亡，此吋单个或少数分散的细胞不易存活，必须加入其他细胞方能使之生存，这种被加入的活细胞称为饲养细胞。一般选用正常小鼠的腹腔巨噬细胞作为饲养细胞。在细胞融合前的1天制备饲养细胞。（1）将健康的Balb/c小鼠眼球放血后拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精屮消毒3〜5min,随即放入超净工作台内，腹部朝上固定于解剖台板上。（2）用锡子提起小鼠腹部皮肤,用剪刀剪一小口，暴露一小块腹膜，再换把剪刀将暴露的腹膜剪一个小口。（3）用
2、滴管吸取适量的不完全RPMI-1640培养液注入小鼠腹腔。反复抽吸、冲洗腹腔3〜4次。（4）抽冋腹腔内液体，注入离心管内。（5）lOOOrpm离心lOmin,弃上清。（6）先用5mlHAT培养液将沉淀细胞悬浮并混匀，做细胞计数，根据细胞计数结果，补加HAT培养液，使细胞浓度为2x105个/ml。（7）将细胞悬液加入96孔培养板内，每孔100?L然后将培养板置37°C5%CO2细胞培养箱内培养。该项操作及以后的操作都必须严格无菌操作。2.2.2.3脾细胞的准备（1）取已经免疫的Balb/c小鼠，摘除眼球放血，并分离
3、血清供检测抗体时的阳性对照用。同时将小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精屮5min,随即放入超净台内。（2）在小鼠腹壁上剪一小口，撕开皮肤，用灭菌银子提起腹膜，剪开左侧腹膜及肋骨，暴露脾脏，换用另一套灭菌器械，用银子提起脾脏，分离结缔组织,取出脾脏。放入盛有5ml不完全培养液的平皿屮，轻轻冲洗一次。（3）再将脾脏移入另一盛有5ml不完全培养液的平皿屮，再冲洗一次，然后用剪刀剪碎。（4）将脾脏碎块装入匀浆器屮，充分研磨。之后用不完全培养液冲洗匀浆器，待人的组织块沉降后，吸取上层的细胞移入50ml离心管屮，加不完全培养液
4、至30ml,混匀。（5）IOOOrpm离心5min,弃去上清。（6）沉淀细胞再用不完全培养液同法离心洗涤一次。然后将细胞重悬至10ml,混匀。（7）取脾细胞悬液活细胞计数后备用。2.2.2.4SP2/0骨髓瘤细胞的准备骨髓瘤细胞的状况直接影响融合结果，生长良好的细胞透亮，边缘光滑清晰。(1)在细胞融合前一周左右复苏SP2/0骨髓瘤细胞，并在细胞融合前36〜48h将骨髓瘤细胞扩大培养。使细胞在融合吋正处于对数生长期。一般融合一次用的细胞数是长到95%左右的75mm2培养瓶4・5瓶。(2)融合时将SP2/0骨髓瘤细胞从
5、瓶壁上吹下，收集于50ml离心管内。(3)lOOOrpm离心5min,弃去上请。(4)用不完全培养液混悬细胞后活细胞计数，取所需细胞数，用不完全培养液洗2次，以10ml不完全的RPMI-1640培养液悬浮备用。2.2.2.5细胞融合将已制备好的脾细胞及SP2/0骨髓瘤细胞混合于灭菌的50ml离心管屮，两种细胞之比为10：1,lOOOrpm离心8min,弃上清，重复上述离心一次后尽量弃去上清。用手指轻轻弹击离心管底部，使沉淀的细胞松散均匀。将离心管倾斜，一手均匀地转动离心管，另一手用1ml吸管匀速加入1ml37°C预
6、热的50%PEG,从加入到加完的吋间控制在60s左右，边加边搅拌。加完后，慢慢摇晃30s,再静置60so立即在随后的5min内加入10ml预热的37°C不完全培养液，使PEG稀释而失去促融作用。在第一分钟和第二分钟分别加1ml,第三分钟和第四分钟分别加入2ml,第五分钟将剩余液体加完。边加边轻轻搅动使PEG和终止液充分混合，动作应轻柔。随后再补加30ml不完全培养液，800rpm离心6min,弃去上清，加入10mlHAT培养液，轻轻吹吸沉淀的细胞，使其悬浮并混匀。根据所用96孔培养板的数量，按一块96孔细胞培养板1
7、0ml计算补加完全培养液之所需量。将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板,每孔1()()?L,37°C5%CO2细胞培养箱内培养。融合后的第三天更换培养液一次，换液时吸去1/2培养液，加入等量新鲜HAT培养液。以后每隔两天换液一次。观察骨髓瘤细胞都死后，大约第七天左右可以换用HT培养液。仔细观察融合细胞的生长状况，凡有污染的孔应立即滴加1%的NaOH,以免污染扩散，如果细胞生长太慢可补加1次饲养细胞。2.2.2.6杂交瘤细胞的筛选融合后，一般过七天开始寻找并记录杂交瘤的生长情况，当杂交瘤细胞长至一•个视野的一
8、•半以上吋，可用建立好的间接ELISA方法检测抗体分泌情况，筛选阳性克隆。取细胞培养上清10071加入已包被好抗原的酶标板中,细胞培养孔补加100?1培养液,其中两孔加入SP2/0培养上清作为阴性对照。两孔加入稀释1000倍的多抗血清作为阳性对照，被检测孔OD值大于阴性孔4倍以上判定为阳性。阴性孔3天后再检测一次，如仍为阴性则弃之。融合比较好的阳性孔应该与阳
