动物细胞培养预习报告-4-复苏和传代.doc

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1、预习报告一第8组复苏和传代培养实验器材器材：青霉索瓶，烧杯，银了，酒精，酒精棉，泡沫衆料板，大头针，纱布，棉绳，牛皮纸,胶头吸管，超净工作台，废液缸，电热恒温箱，打火机，离心机。溶液：酒精，碘酒，Hanks液，培养液，胰蛋白酶液，血清液，EDTA液，冻存细胞。实验步骤…、无菌室准备1、实验环境无菌处理：（1）无菌室消毒：定期清洁，用过氧乙酸熏蒸，紫外线消毒1小时。（2）超净台消毒。（3）实验者准备：紫外灯关闭30min钟后，实验者在缓冲区内穿白大褂，戴口罩，帽子，洗手，泡手，（穿隔离衣），酒精擦手，拿好实验物品进入无菌室（洗手后手不

2、耍再碰缓冲区内其他物品，开门由未完成准备的同学帮忙）。2、无菌技术要领：（1）手指不可触及器材使用端；（2）器材使用端经火焰消毒使用;（3）打开或封闭瓶口,安装吸管等都必须在无菌区进行；（4）开口瓶必须顺风45。斜放，用后及时关闭。3、、实验器材无菌使用：（1）血清瓶、离心管的取用：右手持银子过火，左手打开容器（不要放下盖了），锻了掀开纱布，取岀血清瓶置于台面，银了过火，扯冋纱布，盖好盖了,银了过火，放I叫酒精瓶，整个过程手不要伸进小贮槽内。血清瓶使用Z前，瓶盖放在酒精棉球上，瓶口灼烧灭菌后使用。（2）吸管使用：左手持筒，右手取下筒

3、口包装，倒置于安全区内桌血。消毒筒口，左手抖动至吸管长处筒口，右手取管，左手消毒筒口，右手取筒口包装重新套于筒口，将吸管筒放置于远处。此过程屮，右手吸管保持管口斜向外上，减小污染几率。吸管吸出液体不要太多，移液时要注意吸管口要保胡一段空气柱。移液时吸管不要伸到瓶里放液，而是瓶口微斜，在瓶口外放液。二、超净台操作（一）台血准备：台面消毒，依次放胰蛋白酶液（消化液），血清，EDTA液，酒精灯，废液缸，吸管筒，鼠肺组织在消化液前靠酒精灯位置这样所有的物品就在H己的血前。（二）细胞复苏：（1）取出存放盒和待复苏管（从液氮中取出时要使用银子夹

4、出，不要用手）；（2）取出后立即投入37-38C0的水屮，充分晃动lmin左右，直至管内完全融化；（3）管消毒后入台；（4）取一只干净的离心管，加入与复苏细胞三倍体积的培养液；（5）在2・3分钟内将细胞用吸管加入离心管屮，混匀；（6）低速离心300rpm离心5分钟示取出；（7）去上清液，弹指法打散细胞沉淀；（8）加入新的培养液轻轻混匀，培养24h。甲同学完成（1,2,3）,乙同学完成（4,5,6）,丙同学完成（7,8）（另一种复苏方法：取出存放盒和待复苏管，将复苏管立即投入37-38C0的水屮，充分晃动lmin,管内融化后，直接培养

5、复苏细胞24小时后，进行换液。）（三）传代培养（贴壁细胞）:1、入台处理：（1）取出培养瓶，打开，瓶盖过火消毒放在酒精棉球上，瓶口消毒倒去培养液于配液缸内（倒去的时候肺组织瓶口位于配液缸正屮偏上位置瓶口不能碰到配液缸）肺组织培养瓶口倒置于酒精棉球上面；（2）吸管加入适量hanks液洗后倒掉；（3）换吸管，加胰蛋白酶液0.5ml,翻转培养瓶使消化液侵泡细胞面，30s-lmin后倒掉多余的消化液，剩余的酶液继续作用于细胞。瓶口消毒加盖，出台。2、镜下观察：显微镜下观察细胞质I叫缩逐渐趋向圆形，细胞间隙变加大，多数细胞有变化时（观察瓶面见

6、多数细胞开始滑落时返冋超净台）3、传代：（1）培养瓶消毒后入台；（2）每瓶加lml培养液终止消化，用吸管头轻轻的有序吹打瓶畢细胞（从平底到瓶口，从瓶的一侧到另一侧，注意吹打边角细胞），制成细胞悬液。（3）将消化下来的的细胞归入离心管屮，离心后去上清液。（4）离心沉淀细胞加少量培养液，混匀。（5）分瓶扩大培养：吸管吸取混悬液，分别接种到两个新的培养瓶内，每瓶再补加2毫升培养液,轻轻吹打混匀细胞,37C°,5%CO2培养箱培养，次日换液。（传代培养由三人轮流操作，吸管每个人用的时候要小心不要碰到下端，发生污染）（注意事项：传代消化时，出

7、现细胞层大片脱落时，应适当延长消化时间，才能达到,轻轻吹打细胞分离的目的，若立即停止消化，因消化时间不够，轻吹打，细胞不分离，重吹打，细胞受伤，单个细胞减少，小片层细胞增多，传代细胞常呈孤岛样生长分布，如重复此操作，传代细胞退变，细胞数越穿越少甚至全部死亡，只要适当的延长消化时间，传代细胞呈单个分散态生长，细胞又会逐渐恢复单层生长状态。）三、分丁情况屮：乙：内：细胞复苏由三人合作完成，具体分工在步骤屮己写明。传代培养由三个备自完成，一人主操，两人为助手。