流式细胞检测方法.doc

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1、AnnexinⅤ-FITC细胞凋亡试剂盒使用（细菌）K：不加菲A：5000ug/L菲B:500ug/LC:500ug/L1、在0,24,48,72h取样3ml，测定OD6002、在0,24,48,72h取样，三个平行各取1ml,混匀，6000r/min,离心20分钟，弃上清，收集细胞，用5mlPBS轻轻重悬（注意：PBS重悬不能省略，PBS重悬的过程同时也起到了洗涤细胞的作用，可以保证后续AnnexinV-FITC的结合。）3、实验组（4组）：取K、A、B、C组重悬的细胞，加入5mg/ml的溶菌酶2ml,35

2、℃水浴30Min,6000r/min,离心10分钟，弃上清。4、实验组：各取K、A、B、C组0.1ml于1ml离心管中，定容至1ml左右,混匀。加入10μlAnnexinV-FITC，轻轻混匀；再加入100μl碘化丙啶，轻轻混匀。室温(20～25℃)避光孵育10分钟。5、阳性对照组：取2份K组菌液0.1ml于1ml离心管中，定容至1ml左右,混匀。1管放入沸腾的蒸馏水中煮30min（杀死细胞）,然后加入100μl碘化丙啶（PI）单染，轻轻混匀，另1管加入10ulAnnexinV-FITC单染，轻轻混匀。室温(

3、20～25℃)避光孵育10分钟。6、阴性对照组：另取1份K组菌液0.1ml于1ml离心管中，定容至1ml，混匀，不加任何染色剂。7、将样品过400目筛网，进行流式细胞仪检测。8、AnnexinV-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。9、因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。10、用流式细胞仪检测，激发波长Ex=488nm;发射波长Em=530nm。AnnexinV-FITC的绿色荧光通过F

4、ITC通道（FL1）检测；PI红色荧光通过PI通道（FL2或FL3）检测，建议使用FL3。荧光补偿调节：使用未经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。二醋酸酯荧光素（FDA）与碘化丙啶的流式细胞术1、在0,24,48,72h取样3ml，测定OD6002、在0,24,48,72h取样，三个平行各取1ml,混匀，6000r/min,离心20分钟，弃上清，收集细胞，用5mlPBS轻轻重悬3、取K、A、B、C组重悬的细胞，加入5mg/ml的溶菌酶2ml,35℃水浴30Min,

5、6000r/min,离心10分钟，弃上清。4、实验组：各取K、A、B、C组0.1ml于1ml离心管中，定容至1ml左右,混匀。加入200μlFDA，轻轻混匀；再加入100μl碘化丙啶，轻轻混匀。室温(20～25℃)避光孵育10分钟。5、阳性对照组：取2份K组菌液0.1ml于1ml离心管中，定容至1ml左右,混匀。1管放入沸腾的蒸馏水中煮30min（杀死细胞）,然后加入100μl碘化丙啶（PI）单染，轻轻混匀，另1管加入200ulFDA单染，轻轻混匀。室温(20～25℃)避光孵育10分钟。6、阴性对照组：另取1

6、份K组菌液0.1ml于1ml离心管中，定容至1ml，混匀，不加任何染色剂。7、将样品过400目筛网，进行流式细胞仪检测。8、二乙酸荧光素(FDA)本身无荧光。在细胞的非特异性脂酶的催化下,FDA生成荧光素,后者经480nm激光激发出波长530nm左右的绿色荧光。死细胞的细胞膜不完整,生成的荧光素很快扩散出细胞,不能检测到带有绿色荧光的细胞。碘化丙锭(PI)不能进入具有完整细胞膜的活细胞,当细胞死亡或细胞膜不完整时,PI进入细胞,与DNA相结合,在488nm的激光激发下,在波长660nm左右检测到红色荧光。因此

7、,通过FDA/PI双染色的方法,利用死活细胞在经染色后会激发出不同波长的荧光的特点,即活细胞可检测到FDA产生的荧光信号,而无PI产生的荧光信号,死细胞则相反,这样就可以将死活细胞区分开来。