流式细胞仪常用的几种检测方法.doc

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1、流式细胞仪常用的几种检测方法（转载）一、测定用乙醇固定的DNA的含量1、培养细胞的DNA含量的测定制备单细胞悬液于200μl的PBS缓冲液中；加入2ml预冷的70%乙醇，4℃保存；附:细胞固定的一般步骤1)      取单细胞悬液1～2×106个细胞于PBS（PH=7.2）缓冲液中；2)      300g离心5分钟，弃上清，反复两次；3)      重悬细胞于0.5mlPBS缓冲液中；4)      将细胞悬液放置于2～3ml冷70%乙醇中，混匀，保存于4℃，至少30分钟。在4℃条件下可保存2~3周。注意：²    根据实验的要求，固定剂也可选用1～3%多聚甲醛；²  

2、  将乙醇作为固定剂时，乙醇应预冷至0～4℃；²    细胞在固定时，固定剂应缓慢滴入细胞悬液中，使固定剂的浓度缓慢增加，并不断震摇，以免细胞成团（特别是用乙醇固定时）。²    300g离心5分钟，去上清，再重悬于400μlPBS中；²    显微镜下观察，若有明显的黏附，须再用筛网过滤；²    加入PI（含Rnase），避光孵育30分钟；²    上机检测。2、新鲜组织的DNA含量的测定1)      用200mg湿重组织用机械法制成单细胞悬液；2)      500g离心5分钟；3)      弃上清，重悬于10ml染色-去污剂中；4)      再过滤，用200

3、目的筛网或70~80μm的筛网过滤；5)      上机检测。3、石蜡包埋组织切片的DNA含量的测定1)      从石蜡包埋切取切片50μm厚，2~3片，制成单细胞悬液；2)      用PBS缓冲液洗涤，500g离心5分钟，弃上清；3)      加入PI液1ml室温避光30分钟；4)      调整细胞浓度为1×106/ml；5)      上机检测。二、细胞凋亡检测及相关分子检测1、细胞DNA含量分布（由细胞DNA降解方式检测细胞凋亡）²    收集已固定的单细胞悬液约5×105~1×106/ml；²    离心除去固定液，3mlPBS重悬细胞;²    1500

4、rpm离心，5分钟，弃去PBS；²    加PI染液1ml，室温避光20分钟；²    调整细胞浓度5×105/ml；²    上机检测。2、磷脂酰丝氨酸外翻分析检测细胞凋亡1)      常规制备单细胞悬液,用PBS洗两次.(若为全血要先溶                  血),取约5×106个细胞，1500rpm离心,弃上清,用400μl1×BindingBuffer重悬；2)      分成a、b、c、d、e五管，每管约1×106个细胞a)      阴性对照，不加任何试剂；b)      阳性对照,加2%多聚甲醛固定30分钟,加AnnexinV5μl,室温10m

5、in,用1×BindingBuffer洗一次,弃上清再加190μl缓冲液、10μlPI避光15分钟  c)      加10μlPI，避光孵育15分钟；d)      加5μlAnnexinV液，室温避光孵育15min；e)      加10μlPI和5μlAnnexinV液，室温避光孵育5min；3)      每管各加400μl1×BindingBuffer。4)      上机检测。注意a.操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞；b.操作时注意避光；c.反应完毕后尽快检测，最好在一小时内检测。3、用单克隆抗体APO2.7检测细胞凋亡1)      放置0.5~1×106

6、个细胞到试管中；2)      室温离心200g，6min；3)      弃上清，加入100μl冷的（4℃）在PBSF溶液中含100µg/ml的digitonnin，轻轻地重悬细胞，在冰上孵育20min；4)      加入2ml冷的（4℃）PBSF液，室温离心200g，6min；5)      弃上清，加入20μlPE标记的Apo2.7单克隆抗体和80μlPBSF液，用vortex轻轻震荡，室温避光孵育15分钟；6)      加入2mlPBSF液，室温离心200g，6min；7)      弃上清，加入1mlPBSF液重悬细胞；8)      避光保存，直到流式细胞

7、仪检测。      PBSF：含2.5%FCS（v/v）和0.01%NaN3（w/v）的PBS。三、用流式细胞术进行DNA周期分析    1、方法：同DNA含量检测    2、注意：单细胞浓度应约106/ml，以免影响检测的CV值和检测结果；制备完成后的标本应用光学显微镜检查其质量（如细胞是否聚集或过多碎片），以保证得到足够的细胞含量；醛类固定会影响PI与核酸的结合。四、免疫荧光标记法1、细胞膜上的免疫荧光检测法间接标记法1)      制备单细胞悬液；2)      细胞计数，取出1×106个细胞于试管中；3)      用