目的基因的亚克隆.docx

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1、目的基因的亚克隆所谓亚克隆就是对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。  亚克隆的基本过程包括：(1)目的DNA片段和载体的制备；(2)目的DNA片段和载体的连接；(3)连接产物的转化；(4)重组子筛选。 一、试剂准备1．LB液体培养基：胰化蛋白胨（细菌培养用）10g，酵母提取物（细菌培养用）5g，NaCl10g，加ddH2O至1000ml，完全溶解，分装小瓶，15lbf/in2高压灭菌20min。2．1.5%琼脂LB固体培养基:称取1.5g琼脂粉放入300ml锥形瓶,加100mlLB，15lbf/in2 

2、高压灭菌20min，稍冷却，制备平皿。3．IPTG、X-Gal4．0.1MMgCl2 ：15lbf/in2高压灭菌20min，0℃冰浴备用。5．0.1MCaCl2（以20%甘油水溶液配制）：15lbf/in2高压灭菌20min，0℃冰浴备用。6．限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶。二、目的DNA片段和载体的制备    选择适宜的限制性核酸内切酶，消化已知目的DNA和载体，获得线性DNA，用于重组。根据目的DNA和载体的具体情况，选择一种或者两种适当的限制酶切割，分别产生对称性粘性末端（用一种限制性内切酶进行消化而产生带有互补突出端）、不对称粘性末端（用两种不同的限

3、制性内切酶进行消化而产生带有非互补突出端）、平端。在亚克隆时，首选不对称相容末端连接，次选对称性粘性相容性末端连接，由于平末端连接效率较低，通常很少采用。但有时目的片段的末端与载体不匹配，一般先将不匹配末端补平，然后再以平末端连接。（实验操作同前述） 三、利用T4DNA连接酶进行目的DNA片段和载体的体外连接（一）连接要求和结果 外源DNA片段末端性质连接要求          连接结果不对称粘性末端两种限制酶消化后，需纯化载体以提高连接效率载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；非重组克隆的背景较低；外源DNA可以定向插入到载体中。对称性粘性末端线形载体D

4、NA常需磷酸酶脱磷处理载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；外源DNA会以两个方向插入到载体中。平端要求高浓度的DNA和连接酶载体与外源DNA连接处的限制酶切位点消失；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；非重组克隆的背景较高。带有相同末端(平端或粘端)的外源DNA片段必须克隆到具有匹配末端的线性质粒载体中,但是在连接反应时,外源DNA和质粒都可能发生环化,也有可能形成串联寡聚物。因此，必须仔细调整连接反应中两个DNA的浓度，以便使“正确”连接产物的数量达到最佳水平，此外还常常使用碱性磷酸酶去除5’磷酸基团以抑制载体DNA

5、的自身环化。利用T4DNA连接酶进行目的DNA片段和载体的体外连接反应，也就是在双链DNA5’磷酸和相邻的3’羟基之间形成新的共价键。如载体的两条链都带有5’磷酸（未脱磷），可形成4个新的磷酸二酯键；如载体DNA已脱磷，则只能形成2个新的磷酸二酯键，此时产生的重组DNA带有两个单链缺口，在导入感受态细胞后可被修复。（二）T4DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一般方案1．连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。2．10μl体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例的外源DNA分子（一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为1∶1-1∶5），补

6、足ddH2O至8μl。3．轻轻混匀，稍加离心，56℃水浴5min后，迅速转入冰浴。4．加入含ATP的10×Buffer1μl，T4DNA连接酶合适单位，用ddH2O补至10μl，稍加离心，在适当温度（一般14-16℃水浴）连接8-14hr。四、连接产物的转化1.感受态细胞的制备⑴ 保存于-70℃的DH5α（或其他菌种）用接种环划菌于1.5%琼脂平板上，37℃恒温倒置培养至单菌落出现（约14-16hr）。⑵ 挑取单菌落，接种于2.0mlLB液体培养基中，37℃恒温，250g振荡培养过夜（约12hr）。⑶ 取0.5ml过夜培养液，接种于100mlLB液体培养基中，37

7、℃振荡培养2-2.5hr，至OD600为0.4-0.5时，放置于4℃冰箱冷却1-2hr。（注：以下操作均应在冰浴中进行。）⑷ 将培养液分入两个50ml离心管中，4℃离心，4000g×10min，弃去上清，用冰浴的0.1MMgCl225ml悬浮30min。⑸ 4℃离心,4000g×10min，弃去上清，加入冰浴的0.1MCaCl2-甘油溶液1ml悬浮。⑹ 以100μl/管分装入1.5ml离心管中，-70℃冻存备用。   注：此法制备感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒DNA产生5×106-2×107个菌落，这样的转化效率足以满足所有在质粒中进行的常规克隆的需要，制备的感

8、受态细胞可