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1、耐高温α-淀粉酶发酵条件优化实验方案设计综述：耐高温α-淀粉酶通常采用地衣芽孢杆菌经深层培养、提取等工序精制而成，能随机水解淀粉、糖原及其降解物内部的α-1.4葡萄糖苷健。使得胶状淀粉溶液的粘度迅速下降，变成液化淀粉并裂解产生可溶性糊精和寡聚糖，过度的水解可产生少量葡萄糖和麦芽糖。其液体产品外观呈棕褐色液体,易溶于水,密度为1.15-1.25g/ml。耐高温α-淀粉酶稳定的pH范围为5.0～10.0,有效的pH范围为5.0～8.0。最适pH范围为5.5～7.0,最佳pH范围为6.0～6.2,在淀粉糖化和味精行业生产中均采用的pH范围为6.0～6.2。耐高温淀粉
2、酶在90-95℃范围内非常稳定,淀粉进行喷射液化迅速快捷、完全彻底。在喷射液化工艺中瞬间温度达105-110℃，仍能有效水解淀粉。耐高温α-淀粉酶制剂为有机生化物质，在较低浓度的钙离子存在的情况下有很好的稳定性。对于淀粉的水解，推荐加入50-100ppm钙离子，因此常采用添加自来水的方法提供钙源。日光、温度、湿度易引起酶失活，铜、钛、钴等金属离子对本品也有一定影响，铅、铝、锌等金属离子对该试剂有较强的抑制作用。耐高温α-淀粉酶具有极好的耐热性，能广泛应用于淀粉、酒精、啤酒、味精、酿造、纺织退浆等工业上。近年来随着双酶法制糖工艺在粮食深加工领域的成功应用,该工艺
3、给发酵工业诸如啤酒工业、酒精工业、味精工业、酵母工业、柠檬酸工业、抗菌素工业等带来的巨大的经济效益。这也使得耐高温α-淀粉酶作为一种新型酶制剂得到广泛的应用，且有着良好的发展前景。目前一般企业生产的酶制剂耐高温α-淀粉酶酶活在40000u/ml左右，完全可以满足实际生产中淀粉液化的要求。但是传统在采用地衣芽孢杆菌、米曲霉深层培养发酵得到发酵液中酶活较低，酶活最高仅达到7500u/ml。采用转基因毕赤氏酵母工程菌生产可以提高发酵液中酶活达到25000u/ml。毕赤氏酵母表达系统是目前最优秀应用最广泛的外源基因表达系统之一，它操作简单、表达量高,有着大肠杆菌表达系
4、统和其它酵母表达系统无法比拟的优越之处。为寻求适于工业生产的耐高温α-淀粉酶产生菌及其发酵条件,有必要经过一系列的技术方法改造获得真正意义的用于工业生产的高产菌株生物技术便是手段之一。本实验利用山东大学提供的转地衣芽抱杆菌耐高温α-淀粉酶基因的重组毕赤酵母基因工程菌。通过优化发酵条件来提高酶产量和酶活性,降低生产成本，为工业化发酵生产奠定基础。实验方案设计一、实验目的：1通过优化培养条件提高耐高温α-淀粉酶在基因工程菌中的表达，分泌。现阶段在推荐的培养条件下采用本菌种进行摇瓶发酵实验，测得酶活为5.8-48u/ml。通过不断优化培养条件，使酶活目标达到100-
5、200u/ml。2通过优化分离提取方法提高酶产量和酶活力。3进行初步的扩大培养，为工业化发酵生产提供参考。二、实验原理：毕赤氏酵母不仅能以甲醇作为唯一能源和碳源,而且在甲醇培养基中生长异常迅速,可进行高密度连续培养,当毕赤氏酵母从非诱导的葡萄糖培养基或甘油培养基转移到诱导型的甲醇培养基上时,会大量合成甲醇氧化酶,并在微体中以晶体(非溶蛋白)形式积聚。这一特点对外源蛋白融合表达十分有利,可使它们免受蛋白酶降解且对宿主细胞不产生毒害作用。典型的转基因毕赤氏酵母工程菌表达载体内含有醇氧化酶基因的调控序列(5'AOX1启动子、3'AOX1终止序列、3'AOX1序列),
6、其中含多克隆位点(MCS)供外源基因插入。以巴斯德毕赤氏酵母组氨醇脱氢酶基因(HIS4)作为互补性筛选标志，一般在载体中还包含有某个抗生素抗性基因如AmpR、KanR等。为了更有利于外源蛋白生产的下游加工,构建了毕赤氏酵母的分泌型表达载体。它是在一般胞内融合表达载体的基础上增加了一个分泌信号序列,位于5'AOX1与MCS之间。在这个分泌信号的引导下,导入外源基因的毕赤氏酵母可以以甲醇作为唯一碳源,进行快速繁殖生长。当培养基中的葡萄糖浓度低至0.1g/ml时，毕赤氏酵母会启用甲醇作为能量。此时AOX基因被激活，AOX所在的质粒得到翻译表达，菌体开始产生并分泌耐高
7、温α-淀粉酶。三、实验器材及试剂：菌种：转基因毕赤氏酵母菌试剂：糖蜜PTM1甲醇磷酸缓冲液（PH6.0）尿素甘油硫酸钾七水合硫酸镁盐酸稀碘液等仪器：分光光度计，恒温水浴锅，高压蒸汽灭菌锅，摇床，无菌超净工作台，冰箱，离心机，纱布等四、实验流程（1）目的菌株的选取：本实验采用山东大学提供的目的转基因毕赤氏酵母菌，从地衣芽孢杆菌基因库中分离得到转录翻译成耐高温α-淀粉酶的目的基因，通过重组DNA技术将此目的基因通过重组质粒的形式转移到毕赤氏酵母体内得到的转基因工程菌株。然后在抗生素培养基上进行选择性培养，只有转录进外源基因的毕赤氏酵母才能存活并生长。经过一段时间培
8、养后，从该培养基上挑取单菌落移至斜面培
