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1、发酵过程及优化实验产淀粉酶细菌的优化实验姓名：学号：班级:一、实验目的①回顾配制培养基的原理及配制的一般方法、操作步骤②了解鉴别培养基的原理，并掌握配制鉴别培养基的方法和步骤③了解分批培养时微牛物牛长曲线形成的原理及各时期的主要特点④学习微生物生长曲线和产物形成曲线的测定方法⑤掌握分光光度法测定液化型淀粉酶活力的基本原理和方法⑥了解发酵条件对产物形成的影响，用单因子试验找出实验菌株的最佳培养条件二、实验原理对于淀粉酶产生菌的筛选，用的是在含有淀粉的培养基中培养微生物，滴加碘液进行染色，若出现透明圈，则表明该菌能产生
2、胞外淀粉酶。将少量微生物接种到一定体积的新鲜培养基中，在适宜条件下培养，定时测定培养液中微牛物的牛长量，以牛长量为纵坐标，培养时间为横坐标绘制的曲线就是生长曲线。依据生长速率的不同，一般把生长曲线分为延滞期、对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。本实验用比浊法來测定。淀粉遇碘呈蓝色，这种淀粉■碘复合物在660nm处有较大的吸收峰，可用分光光度计测定。随着酶的不断作用，淀粉长链被切断，生成小分子糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定Q■淀粉酶的活力。最后，在相同碳含量的条件下，配
3、制不同碳源的培养基，测试产淀粉菌对不同碳源的利用情况。三、材料与器材1.菌种枯草芽砲杆菌2.培养基普通培养基:牛肉膏3g,蛋白腺10g,NaCl5g,自来水lOOOmL,pH7・2~7・4。鉴别型培养基：牛肉膏3g,蛋白腺10g,可溶性淀粉10g,NaCl5g,琼脂20自来水lOOOmL,pH7.2〜7.4。不同碳源的培养基：①葡萄糖：牛肉膏3g,蛋口腺10g,葡萄糖2g,NaCl5g,自来水100ml,pH7.2~7.4②可溶性淀粉：牛肉膏3g,蛋白腺10g,可溶性淀粉1.818g,NaCI5g,自来水100ml
4、,pH7.2〜7.4③果糖：牛肉膏3g,蛋白月东10g,果糖2g,NaCl5g,自来水100ml,pH7.2〜7.4①蔗糖：牛肉膏3g,蛋口腺10g,蔗糖1.905g,NaCI5g,自來水100ml,pH7.2~7.4②乳糖:牛肉膏3g,蛋白腺10g,乳糖1.905g,NaCI5g,自来水100ml,pH7.2〜7.43•器皿：电子天平，烧杯，锥形瓶，量筒，培养皿，玻棒，涂布棒，移液管,pH试纸，棕色瓶，容量瓶，高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，分光光度计，摇床，恒温水浴锅等。4.药品：牛肉膏，蛋白腺，氯化钠，蒸谓水，可
5、溶性淀粉，琼脂，NaOH,碘化钾，碘，十二水合磷酸氢二钠，柠檬酸，乙酸，葡糖糖，果糖，蔗糖，乳糖。5.试剂（1）碘原液：称取碘化钾22g,加少量蒸谓水溶解，加入碘llg,溶解后定容至500mL,贮于棕色瓶中。（2）比色稀细碘液：取碘原液2mL,加碘化钾20g,用蒸憾水定容至500mL,贮于棕色瓶中。（3）2%可溶性淀粉：称取可溶性淀粉（干燥至恒重）2g,用少量蒸谓水混合调匀，倒入煮沸的蒸憾水中，边加边搅拌，煮沸2min后冷却，加水定容至lOOmLo须当天配制。（4）pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：称取磷酸氢二钠
6、（旳2肝0_12也0）4.523g,柠檬酸0.807g,用水溶解并定容至lOOmLo（5）0.5mL/L乙酸溶液：0.5mL乙酸溶液定容至1L（6）0.85%生理盐水：0.425gNaCI溶于50ml蒸憾水中6.其他：药匙，记号笔，报纸等。四、实验步骤及数据2011年10月25日①配制基本培养基1150ml,分装50ml至250ml锥形瓶屮，共23瓶，用来扩增实验菌株；②配制鉴别培养基：其中可溶性淀粉分为两个梯度，每个梯度配制100ml,两个梯度的可溶性淀粉含量分别为lg、1.8g;③配制稀释用的生理盐水0.85%
7、,63ml（l4根小试管每根分装4.5ml生理盐水）④包扎培养皿（9套）、锥形瓶（250mlX23）、移液管（lmlXlO）⑤121°C下灭菌20min⑥将实验用菌株用生理盐水梯度稀释:101010巳10弋102IO”、IO?,加入lg淀粉的培养基选1010W7梯度涂平板,加入l・8g淀粉的培养基选10七10°、10〈梯度涂平板，每淀粉含量每梯度涂两块平板，共12块。⑦在30°C下，培养两天2011年10月27日①观察生长状况，挑选有单菌落的平板，在菌落周围滴加碘液，看是否出现透明圈②若出现透明圈（且透明圈
8、较大），则挑取该菌落到基本培养基中，制成菌悬液，30°C、180rpm.摇床过夜，另挑取该菌落于斜面斜面培养基中保存。③菌落计数稀释倍数W710'610'5菌落数（个）560无法计数15无法计数④计算细菌个数原菌悬液浓度：n=（5+15）4-2X107X5=7.5X108（个/mL）细菌个数：N=7.5X108X5=3.75X109（个）即原先平板上大约有3
