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1、发酵过程及优化实验产淀粉酶细菌的优化实验姓名:学号:班级:一、实验目的①回顾配制培养基的原理及配制的一般方法、操作步骤②了解鉴别培养基的原理,并掌握配制鉴别培养基的方法和步骤③了解分批培养时微牛物牛长曲线形成的原理及各时期的主要特点④学习微生物生长曲线和产物形成曲线的测定方法⑤掌握分光光度法测定液化型淀粉酶活力的基本原理和方法⑥了解发酵条件对产物形成的影响,用单因子试验找出实验菌株的最佳培养条件二、实验原理对于淀粉酶产生菌的筛选,用的是在含有淀粉的培养基中培养微生物,滴加碘液进行染色,若出现透明圈,则表明该菌能产生
2、胞外淀粉酶。将少量微生物接种到一定体积的新鲜培养基中,在适宜条件下培养,定时测定培养液中微牛物的牛长量,以牛长量为纵坐标,培养时间为横坐标绘制的曲线就是生长曲线。依据生长速率的不同,一般把生长曲线分为延滞期、对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。本实验用比浊法來测定。淀粉遇碘呈蓝色,这种淀粉■碘复合物在660nm处有较大的吸收峰,可用分光光度计测定。随着酶的不断作用,淀粉长链被切断,生成小分子糊精,使其对碘的蓝色反应逐渐消失,因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定Q■淀粉酶的活力。最后,在相同碳含量的条件下,配
3、制不同碳源的培养基,测试产淀粉菌对不同碳源的利用情况。三、材料与器材1.菌种枯草芽砲杆菌2.培养基普通培养基:牛肉膏3g,蛋白腺10g,NaCl5g,自来水lOOOmL,pH7・2~7・4。鉴别型培养基:牛肉膏3g,蛋白腺10g,可溶性淀粉10g,NaCl5g,琼脂20自来水lOOOmL,pH7.2〜7.4。不同碳源的培养基:①葡萄糖:牛肉膏3g,蛋口腺10g,葡萄糖2g,NaCl5g,自来水100ml,pH7.2~7.4②可溶性淀粉:牛肉膏3g,蛋白腺10g,可溶性淀粉1.818g,NaCI5g,自来水100ml
4、,pH7.2〜7.4③果糖:牛肉膏3g,蛋白月东10g,果糖2g,NaCl5g,自来水100ml,pH7.2〜7.4①蔗糖:牛肉膏3g,蛋口腺10g,蔗糖1.905g,NaCI5g,自來水100ml,pH7.2~7.4②乳糖:牛肉膏3g,蛋白腺10g,乳糖1.905g,NaCI5g,自来水100ml,pH7.2〜7.43•器皿:电子天平,烧杯,锥形瓶,量筒,培养皿,玻棒,涂布棒,移液管,pH试纸,棕色瓶,容量瓶,高压蒸汽灭菌锅,超净工作台,分光光度计,摇床,恒温水浴锅等。4.药品:牛肉膏,蛋白腺,氯化钠,蒸谓水,可
5、溶性淀粉,琼脂,NaOH,碘化钾,碘,十二水合磷酸氢二钠,柠檬酸,乙酸,葡糖糖,果糖,蔗糖,乳糖。5.试剂(1)碘原液:称取碘化钾22g,加少量蒸谓水溶解,加入碘llg,溶解后定容至500mL,贮于棕色瓶中。(2)比色稀细碘液:取碘原液2mL,加碘化钾20g,用蒸憾水定容至500mL,贮于棕色瓶中。(3)2%可溶性淀粉:称取可溶性淀粉(干燥至恒重)2g,用少量蒸谓水混合调匀,倒入煮沸的蒸憾水中,边加边搅拌,煮沸2min后冷却,加水定容至lOOmLo须当天配制。(4)pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液:称取磷酸氢二钠
6、(旳2肝0_12也0)4.523g,柠檬酸0.807g,用水溶解并定容至lOOmLo(5)0.5mL/L乙酸溶液:0.5mL乙酸溶液定容至1L(6)0.85%生理盐水:0.425gNaCI溶于50ml蒸憾水中6.其他:药匙,记号笔,报纸等。四、实验步骤及数据2011年10月25日①配制基本培养基1150ml,分装50ml至250ml锥形瓶屮,共23瓶,用来扩增实验菌株;②配制鉴别培养基:其中可溶性淀粉分为两个梯度,每个梯度配制100ml,两个梯度的可溶性淀粉含量分别为lg、1.8g;③配制稀释用的生理盐水0.85%
7、,63ml(l4根小试管每根分装4.5ml生理盐水)④包扎培养皿(9套)、锥形瓶(250mlX23)、移液管(lmlXlO)⑤121°C下灭菌20min⑥将实验用菌株用生理盐水梯度稀释:101010巳10弋102IO”、IO?,加入lg淀粉的培养基选1010W7梯度涂平板,加入l・8g淀粉的培养基选10七10°、10〈梯度涂平板,每淀粉含量每梯度涂两块平板,共12块。⑦在30°C下,培养两天2011年10月27日①观察生长状况,挑选有单菌落的平板,在菌落周围滴加碘液,看是否出现透明圈②若出现透明圈(且透明圈
8、较大),则挑取该菌落到基本培养基中,制成菌悬液,30°C、180rpm.摇床过夜,另挑取该菌落于斜面斜面培养基中保存。③菌落计数稀释倍数W710'610'5菌落数(个)560无法计数15无法计数④计算细菌个数原菌悬液浓度:n=(5+15)4-2X107X5=7.5X108(个/mL)细菌个数:N=7.5X108X5=3.75X109(个)即原先平板上大约有3