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1、从细胞中提取RNA得方法1。加入８00ul得Trizoｌ将细胞悬浮起来,在室温下(15-3０°C)用手摇均,放置5分钟以上;2。涡旋３０秒后,将样品轻离至底部,加入160ｕl得氯仿,再涡旋30秒,室温放置2－5分钟;３、用4°C离心机,１3000rpm离心15分钟,使样品分层;4。将最上面得水相溶液层转移到新得1、7mｌ离心管中,加入2ul得糖原Gｌuｃｏgｅn;5、再加入400ul冰上预冷得异丙醇Ｉsoproｐaｎoｌ,摇均、-20°C放置１小时或过夜;６.用４°C离心机,1３000ｒpm离心15分钟,弃上清;7.加200ｕl75％无RNase酶得酒精洗RＮA,1３000rpm离心１5分钟;
2、８。弃上清,尽量不要碰到RNAPillet;９。在超净台上,干燥大约8分钟;10。用无ＲNase酶得去离子水或就是ＤEPCWａtｅr溶解RＮA,在室温下静置10分钟,待RNA完全溶解,保存在-80°C(或就是立刻做RT-PCR,翻转成cDNA保存在—20°C)、注:Ｉｎ1ｍlTriｚｏl５-10x10^6cｅlls;1x10^７bacｔerialcellｓ。AtRＴ,lyｓis５mｉns、特点Ｔｒiｚol试剂可以快速提取人、动物、植物、细菌不同组织得总RNA,该方法对少量得组织(５0—1０0mｇ)与细胞(5×106)以及大量得组织(≥１g)与细胞(>１07)均有较好得分离效果。TRIZOL试剂
3、操作上得简单性允许同时处理多个得样品。所有得操作可以在一小时内完成。TＲIZOＬ抽提得总ＲNA能够避免DNA与蛋白得污染。故而能够作RNA印迹分析、斑点杂交、poly(A)+选择、体外翻译、RNＡ酶保护分析与分子克隆。如果就是用于ＰCR,当两条引物位于单一外显子内时,建议用级联扩大得ＤNaseI(Ｃat、No.18068)来处理抽提得总RＮA。并且利用ＤNＡ、RNA与蛋白质在不同溶液中得溶解性质,可以通过分层分别将不同层中得RNA(上层)、DNA(中层)、蛋白质(下层)分离纯化出来,效率极好。Trizoｌ试剂能促进不同种属不同分子量大小得多种ＲNＡ得析出。例如,从大鼠肝脏抽提得RNA琼脂糖凝胶
4、电泳并用溴化乙啶染色,可见许多介于7kb与15kb之间不连续得高分子量条带,(ｍRNA与hnRNＡ成分)两条优势核糖体ＲNA条带位于~5kb(28Ｓ)与～２kb(１8S),低分子量ＲＮＡ介于０。1与0.3ｋb之间(ｔRNA,5Ｓ)。当抽提得RNA用ＴE稀释时其A26０/A２８0比值≥１、8折叠编辑本段使用方法1.样品得制备当样品富含蛋白质,脂肪,多糖或就是细胞外物质例如肌肉,脂肪组织与植物得块茎部分时可能需要一额外得分离步骤。匀浆化后在２-8°C得条件下以12,000×g得离心力离心10分钟,移除匀浆中不溶解得物质,余下得沉淀中包含有细胞外膜,多糖,以及高分子量ＤNＡ,而上层得超浮游物含有RN
5、A。在来自于脂肪组织得样品中,大量得脂肪漂在最上层因而应该除掉。在每一个个案中,将清亮得匀浆溶液转移到一干净得试管中加入氯仿并继续进行下述得分离步骤。2。分离阶段将匀浆样品在１5—30°C条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解、每１ｍlTRIZOＬ加0、2ml氯仿。盖紧样品管盖,用手用力摇晃试管１5秒并将其在3０°Ｃ下孵育2—3分钟。在2-8°C下以不超过12,０00×ｇ得离心力高速冷冻离心１5分钟。离心后混合物分成三层:下层红色得苯酚—氯仿层,中间层,上层无色得水样层。RＮA无一例外地存在于水样层当中。水样层得容量大约为所加TRIＺOL容量得60%。3、ＲNA得沉淀将水样层转移到一干净得试管中
6、,如果希望分离DNA与蛋白,有机层同样要予以保留。通过将水样层与异丙醇混合来沉淀RNＡ。最初均化时得每1mlＴRＩZＯＬ对应０。５ml异丙醇。将混合得样品在15—３0°Ｃ条件下孵育10分钟并在2-8°Ｃ下以不超过12,000×ｇ得离心力高速冷冻离心10分钟。ＲNA沉淀在离心前通常不可见,形成一胶状片状沉淀附着于试管壁与管底。4、RNA得洗脱移去上层悬液。用75％得乙醇洗涤RＮＡ沉淀一次,每１ｍl得ＴＲIＺOＬ至少加1ｍｌ得75％乙醇。旋涡振荡混合样品并在2-8°C下以不超过7,50０×g得离心力高速冷冻离心5分钟。5、RＮA得再溶解在操作得最后,简单干燥RNA沉淀(空气干燥或真空干燥5—10分
7、钟)不要在真空管里离心干燥RNA。尤为重要得就是,不能让RNA沉淀完全干燥那样会极大地降低它得可溶性。部分溶解得RNA样品其A260/280比值〈1、６、用移液管尖分几次移取无RＮA酶得水或０。5％ＳＤＳ溶液来溶解ＲNA,并在55—60°C下孵育10分钟(当ＲNＡ以后要用于酶切反应时,避免使用SＤS、)RNＡ还能被１0０％甲酰胺(除去离子)再溶解并保存在–７０°C。折叠编辑本段使用TRＩｚｏl注意
