第3章 临床微生物学检验技术ppt课件.ppt

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1、第3章临床微生物学检验技术请回答一下问题哪些细菌适合直接涂片检查？直接涂片检查能为临床提供哪些信息？细菌分离培养和鉴定常用的培养基有哪些特点？与分离培养相比，应用分子生物学方法检测有哪些优缺点？临床微生物检验的任务?一、细菌形态学检验不染色标本检查生活状态下细菌的动力及运动状况压滴法和悬滴法病原菌初步鉴定：霍乱弧菌制动试验染色标本革兰染色抗酸染色荧光染色鞭毛染色荚膜染色特殊染色：异染颗粒、芽胞染色、墨汁染色一、细菌形态学检验（一）制片1.涂片取洁净载玻片一张，用标记笔一分为二，用接种环取生理盐水2环

2、，分别置于玻片两端，接种环灭菌后，取金黄色葡萄球菌斜面培养物少许与盐水混匀，并涂成均匀薄膜涂片。接种环灭菌后以同样方法再取大肠埃希菌少许，与另一端生理盐水混匀后涂成均匀薄膜。如用液体材料，如痰、尿液、脓汁等可直接涂片，不必加生理盐水。2.干燥涂片最好在室温下自然干燥，必要时可将标本面向上，小心间断地在弱火高处烘干，但切勿紧靠火焰将涂膜烤枯。3.固定涂片干燥后，将标本片在酒精灯上快速的来回通过三次，共约2s～3s，注意温度不可太高，以涂片涂膜的反面触及皮肤觉轻微烫觉即可。固定目的：①杀死细菌；②使菌体

3、与玻片粘附较牢，在染色时不致被染液和水冲掉；③菌体蛋白变性易着色。涂片干燥固定染色镜检（二）革兰染色法1.原理（1）革兰阳性细菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易渗入；革兰阴性菌细胞壁结构较疏松，肽聚糖层少，脂质含量多，乙醇易渗入。（2）革兰阳性菌的等电点低，革兰阴性菌的等电点较高，在相同pH条件下，革兰阳性菌所带负电荷比革兰阴性菌多，与带正电荷的结晶紫染料结合较牢固不易脱色。（3）革兰阳性菌细胞内含有大量核糖核酸镁盐，可与结晶紫和碘牢固的结合成大分子复合物，不易被乙醇脱色；而

4、革兰阴性菌细胞内含极少量的核糖核酸镁盐，吸附染料量少，形成的复合物分子也较小，故易被乙醇脱色。2.染色方法（1）标本涂片、干燥和固定。（2）染色：在已固定细菌涂片上滴加结晶紫染液数滴，室温作用1min，用细流水轻轻冲洗，甩去积水。再滴加碘液数滴，室温作用1min，冲洗。滴加95%酒精数滴，轻轻摇动玻片几秒钟，使均匀脱色，然后斜持玻片，使脱掉的染料随酒精流去，再滴加酒精，直到流下的酒精无色为止（约需30s），立即用细流水将酒精冲掉。再滴加稀释石炭酸复红液复染约30s后用细流水冲洗。（3）标本染色后

5、，晾干或用吸水纸吸干，滴香柏油后用油镜观察。3.结果紫色为革兰阳性菌，红色为革兰阴性菌。（二）抗酸染色1.原理分枝杆菌细胞壁含脂质较多，其中主要成分为分枝菌酸，此物具有抗酸性，染色时与石炭酸复红结合牢固，能抵抗酸性乙醇的脱色作用，因此抗酸菌能保持复红的颜色，达到染色目的。2.方法（1）萋纳石炭酸复红染色，加温促使菌体着色5min；（2）流水冲洗，3%盐酸酒精脱色1~3min；（3）吕氏美蓝复染30s。3.结果未脱色细菌呈红色为抗酸性细菌,脱色经复染呈蓝色的细菌为非抗酸性细菌。（三）鞭毛染色1.原理细

6、菌的鞭毛能被碱性复红酒精饱和溶液着色，是因为在染色过程中随着酒精的蒸发其染料沉积在鞭毛上，使鞭毛着色。碱性复红作为主要染料，而丹宁酸为媒染剂。2.方法（1）采用点种法接种的变形杆菌（或其他鞭毛菌），近离接种点的菌，鞭毛细，菌体较短；远离接种点的菌，鞭毛粗，菌体长，用无菌接种环取远离接种点的菌混悬于盛有无菌蒸溜水的平皿内，不要研磨以免鞭毛脱落，置室温放置10～15min，使鞭毛膨大。（2）用毛细滴管将菌液滴于洁净的玻片上，缓慢倾斜玻片任菌液流开，始之成为均匀薄膜，将玻片置37℃温箱内，任其自然干燥，

7、切勿用火焰固定。（3）在干燥标本片上滴加鞭毛染色液1～2滴，使覆盖于薄膜上，作用1～2min后轻轻用水冲，干后镜检观察。3.结果菌体染成红色（或深紫色），鞭毛染成淡红色（或淡紫色），染色时间越长，鞭毛越粗。（四）荚膜染色1.原理荚膜为细菌细胞壁外围的黏液层，对染料的亲和力很低，用一般染色不易着色，必须通过荚膜染色方法或衬托染色，方能清晰辨认出荚膜。2.方法用有荚膜的细菌培养物涂片，火焰固定，固定标本后加1%结晶紫染液，室温保持1min后，倒去染液，然后用20%硫酸铜水溶液冲洗染液，勿水洗。待干后镜

8、检观察。3.结果菌体为深紫色，荚膜为无色或淡紫色。（四）墨汁染色1.原理2.方法3.结果菌体为深紫色，荚膜为无色或淡紫色。（一）培养基分类成分用途形态血平板巧克力血平板伊红美蓝平板麦康凯平板SS平板M-H平板培养基的选择根据标本来源和可能存在的病原菌血平板巧克力血平板中国蓝平板或伊红亚甲蓝平板麦康凯平板SS琼脂碱性琼脂或TCBS琼脂血液增菌培养基营养肉汤分离培养细菌的分离平板划线分离法斜面接种法液体接种法穿刺接种法倾注培养法涂布接种法二、分离培养（一）划线接种1.方法