细胞培养与生长测定ppt课件.ppt

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1、细胞培养的生长测定细胞培养的生长测定是指对细胞活力和细胞增殖的测定1.细胞计数法2.台盼蓝染色法3.MTT比色法4.细胞生长曲线法一、细胞计数法细胞计数法是用血细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数目，以测定细胞增殖和调整细胞密度。【材料】1.消化液：0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合消化液2.细胞培养液3.血细胞计数板和盖玻片【操作程序】处理贴壁生长细胞时，吸出培养液，加入消化液，在37℃条件下消化1-2min。待细胞变圆并将脱壁时，加入一定量的培养液，用吸管冲洗细胞，制成细胞悬液。对于悬浮培养的细胞，可直接制成细胞悬液。将盖玻片放在血细胞计数板的2个小室上。用毛细吸管或装

2、有注射针的1ml注射器吸取少量细胞悬液，然后将细胞悬液轻轻注入盖玻片边缘与计数板交界处。通过盖玻片和计数板之间的毛细管虹吸作用，细胞悬液进入小室，并充满盖玻片和计数板的间隙。3.在显微镜100倍放大倍数下用计数器计数四角大方格中的细胞数，即每个小室的中央方格和四角的方格。将压左边中线和上边中线的细胞计数在内，不计数压在右边中线和下边中线的细胞。4.计数结束后，分别用双蒸水和70%酒精清洗细胞计数板和盖玻片，然后用擦镜纸擦干。结果分析细胞密度（个/ml）=平均细胞数×104×稀释倍数。细胞总数（个）=细胞密度×细胞悬液量注意事项如果被计数的细胞不再使用，在消化后不需要加入培养液。

3、在显微镜下观察细胞消化程度，以估计取细胞时间。消化时间过短时，部分细胞仍牢固贴壁，故取得的细胞较少，从而影响细胞计数。消化时间过长时，细胞受损，活性减弱。将细胞悬液充分混匀，以免计数结果出现偏差。向盖玻片和计数板之间注入细胞悬液时，以盖玻片下的间隙刚被充满为准。不满或过满都影响实验结果。每个大方格中的细胞密度以20-50个为宜。如果细胞密度太大，稀释后再次计数，以便提高细胞计数的精确度和速度。二、台盼蓝染色法在细胞的分离、传代、冻存和复苏等过程中，均可导致细胞的死亡。台盼蓝染色法用于检测存活细胞数。【材料】消化液：0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合消化液。培养液或HBS

4、S。0.4%台盼蓝溶液，用PBS配制。细胞计数板和盖玻片。【操作程序】处理贴壁生长细胞时，吸出培养液，加入消化液，在37℃条件下消化1-2min。待细胞变圆并将脱壁时，加入一定量的培养液或HBBS，用吸管冲洗细胞，制成细胞悬液。对于悬浮培养的细胞，可直接制成细胞悬液。取0.5ml台盼蓝溶液，0.3mlHBBS和0.2ml细胞悬液，充分混匀。然后，将混合液放置1-2min。用毛细吸管或装有注射针的1ml注射器吸取少量细胞悬液注入盖玻片边缘与计数板交界处。至少计数500个细胞，并计数其中着色细胞。计数结束后，分别用双蒸水和70%酒精清洗细胞计数板和盖玻片，然后用擦镜纸擦干。【结果分

5、析】正常细胞不被着色。细胞死亡后，细胞膜通透性增加，台盼蓝进入细胞内，故细胞呈蓝色。细胞活力（%）=（细胞总数-着色细胞数）/细胞总数×100%注意事项如果含有台盼蓝的细胞悬液放置时间过长，正常细胞可摄取染料，从而影响染色结果。台盼蓝染色法是一种粗略的检测存活细胞的方法，不能准确的反映细胞活性的差异。因此，应使用MTT比色法或凋亡检测法评价细胞活性或检测早期凋亡细胞。三、MTT比色法ＭＴＴ法建立于20世纪80年代初，是一种通过测定细胞能量代谢水平用以间接反映细胞增殖情况的检测方法。其原理是MTT可作为哺乳类动物细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢

6、酶可将淡黄色的MTT还原成紫蓝色的晶状甲瓒(Formazan)，将结晶的甲瓒溶解释放，再用酶联免疫检测仪测定吸光度OD值，OD值的高低可间接反映活细胞的数量及其活性。活细胞多则吸光度大，反之则吸光度小，从而反映出你的细胞的存活及增殖情况。它基于两个假设：1、只有活细胞能够将MTT还原成为难溶性的蓝紫色结晶物，而死细胞不能达到；2、其吸光度与活细胞数量成直线正相关。【材料】1、MTT溶液：称取250mgMTT，放入小烧杯中，加50mlPBS(0.01mol／L，pH7.2)，在电磁力搅拌机上搅拌30min，用0.22um的微孔滤器除菌，分装，4℃避光保存。两周内有效。2、含10％

7、胎牛血清RPMl1640培养液、0.25％胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)3、96孔培养板(单层生长的细胞选用平底型培养板，悬浮生长的细胞选用圆底型培养板)、可调移液器、吸管、离心管、计数板4、孵箱、显微镜、振荡混合仪、酶联免疫检测仪【操作程序】1、接种细胞：用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10%胎牛血清的RPMl604培养液配成单个细胞悬液，以每孔100－1000个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200ul。2、培养细胞；将培养板移入CO2孵箱中，在37℃、5%CO2及湿度条件