郜刚分子生物学06酵母双杂交ppt课件.ppt

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1、山西师范大学生命科学学院郜刚分子生物学讲义2008-11-10星期一1课时体外蛋白质相互作用技术简介体外蛋白质相互作用技术简介protein-proteininteractionnetwork1、FarWesternblottingFar-Western印迹：Far-Western印迹最初发明用于32P标记的GST-融合蛋白表达文库的筛选，现在则用于检测蛋白质-蛋白质相互作用。最近几年，Far-Western还用于检测受体-配体相互作用以及相互作用蛋白文库的筛选谷胱甘肽转硫酶(GlutathioneS-tr

2、ansferase)p208Far-Western印迹技术与Western印迹十分相似，原理基本相同，检测手段和流程基本相同：用SDS-PAGE（十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）或非变性PAGE分离含有未知靶蛋白的样品（通常为细菌裂解液）然后转膜。靶蛋白附于转移膜表面时可以被检测到。转膜后，封闭膜，用一已知诱饵蛋白（通常用纯品）进行探测。诱饵蛋白与靶蛋白反应后，运用该诱饵蛋白的特异性检测系统即可检测出相应条带。蛋白印迹中封闭液的作用:是封闭未吸附蛋白的部位，以减少非特异性结合背景的影响。常用的封闭液有脱

3、脂奶粉、小牛血清等Far-westernblotting与westernblotting的区别Far-westernblottingisamolecularbiologicalmethodwhichisbasedonthetechniqueofwesternblotting.Whileusualwesternblottingusesanantibodytodetectaproteinofinterest,far-westernblottingusesanon-antibodyprotein,whichcan

4、bindtheproteinofinterest.Thus,whereaswesternblottingisusedforthedetectionofcertainproteins,far-westernblottingisratheremployedtodetectprotein:proteininteractions.LLGelLabled“bait”proteinwithnon-antibodyprotein“L”1.电泳转膜2.标记的诱饵蛋白与靶蛋白互作结合3.非放标记3.放射性标记4.化学法光物质

5、HRP与标记物抗体连接，CCD检测发光4.放射自显影检测LHRPlightLmembraneFar-westernblotting2、GST融合蛋白沉降技术利用GST对谷胱甘肽偶联的琼脂糖球珠的亲和，从混合蛋白质样品中纯化得到相互作用蛋白。发生相互作用不发生相互作用P208-210谷胱甘肽转硫酶(GlutathioneS-transferase)3、蛋白质芯片技术蛋白质芯片可以用来大规模筛选蛋白之间的相互作用。将荧光标记的探针蛋白与蛋白质芯片孵育，洗脱非特异性结合的蛋白后，可以通过扫描芯片上的荧光点检测到稳

6、定的相互作用蛋白点。4、等离子表面共振技术将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面并固定于纳米级厚度的金属膜上。当蛋白质混合物经过时，如果有靶蛋白同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，导致共振角度的改变。被固定的诱饵蛋白5、免疫共沉淀技术将靶蛋白的抗体连接到固体基质上，再将可能与靶蛋白发生相互作用的待筛选蛋白加入反应体系中，用低离心力沉淀或微膜过滤法在固体基质和抗体的共同作用下将蛋白复合物沉淀到试管的底部或微膜上。6.细胞内蛋白质相互作用研究—荧光共振能量转移法（FRET）FRET荧光能量

7、转移有三个基本条件：（1）给体与受体在合适的距离（1～10nm）；（2）给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠（这是能量匹配的条件）；（3）给体与受体的偶极具有一定的空间取向（这是偶极-偶极耦合作用的条件）。FRET需要有两个探针，即荧光给体和荧光受体，要求给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠，而与受体的发射光谱尽量没有重叠。不同蛋白的吸收和发射波长不同，可根据需要组成不同的探针对。常用的探针有：荧光蛋白，一类能发射荧光的天然蛋白及其突变体。传统有机染料，具有特征吸收和发射光谱的有机化合物组成的染

8、料对。包括荧光素、罗丹明类化合物和青色染料Cy3、Cy5等。镧系染料，金属染料。一般与有机染料联用，分别作为FRET的给体或受体，以提高检测的准确性和信噪比。其它分子生物学技术郜刚分子生物学分子生物学技术讲义山西师范大学生命科学学院1.凝胶滞缓实验凝胶滞缓实验electrophoreticmobilityshiftassay凝胶滞缓试验（gelretardationassay），又叫作DNA迁移率变动试验（DNA