现代仪器分析--HPLCppt课件.ppt

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1、第二十二章高效液相色谱法highperformanceliquidchromatography中药化学与分析教研室本章内容介绍第一节概述第二节高效液相色谱仪第三节高效液色谱法的基本理论第四节各类高效液色谱法第五节固定相第六节流动相第七节HPLC分析条件的选择第八节定性与定量分析第九节LC-MS联用技术简介第十节超临界流体色谱法简介第一节概述HPLC是在经典液相色谱基础上引入GC的理论和技术,采用：高速——高压泵高效——固定相；高灵敏度——检测器HPLC与经典液相色谱的比较高速：HPLC采用高压输液设备

2、，流速大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV——10-9g,荧光检测器——10-11g。HPLC和GC的比较流动相：HPLC液体种类多，可选范围多GC气体，种类少，改变载气影响柱效和分离少固定相：HPLC新型吸附剂，化学键合相，粒度小GC吸附剂，担体+吸附剂，粒度大应用范围：HPLC高沸点，难挥发，对热不稳定物质GC低沸点，

3、易挥发，对热稳定物质此外，HPLC流出组分可以收集，检测器灵敏度高。高效液相色谱仪第二节高效液相色谱仪HPLC仪组成：输液系统;进样系统;分离系统;检测系统;数据处理系统。流程及主要部件processandmainassemblyofHPLC1.流程主要部件输液系统（一）流动相贮器耐酸碱的瓶子（棕色或无色），高于泵体，保持输液静压差。（二）脱气装置液体流动相使用前要脱气，除去其溶解的气体。（基线噪音，氧化组分！！）方法：（1）超声波振动脱气（2）抽真空脱气（3）加热回流脱气（4）吹氦脱气（5）真空在线

4、脱气(三)高压输液泵要求：流量准确可调，耐高压（30MPa），液流稳定，泵的死体积小。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性双泵串联补偿法将两个柱塞杆往复泵串联,泵1比泵2体积大一倍,柱塞杆运动方向相反。（目的是：减少输液脉冲）泵1泵2色谱柱吸（排）排（吸）(四)梯度淋洗装置梯度洗脱：分离过程中，随时间函数程序地改变流动相的组成（极性，PH或离子强度）。类型：高压梯度低压梯度外梯度（二元高压梯度）

5、:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度（四元低压梯度）:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。二.进样系统（一）六通进样阀流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：优点：进样精确，重现性好。三.色谱分离系统（一）保护柱位置：接在色谱柱之前，保护色谱柱。柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5cm。填料跟分析柱一样，粒径大。（二）色谱柱柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，

6、柱长5～40cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。常用的分析柱是内径2～4.6mm，柱长10～25cm（三）柱恒温箱精确控制柱温可以提高保留时间的重现性。柱温升高，保留时间减少。常用温度：室温-65度（四）色谱柱柱效的评价《中国药典》05版规定：建立HPLC法时，需要进行“色谱条件与系统适应性”实验。最佳分离状态下色谱柱应达到的：n理论？分离度R？拖尾因子T？四.检测系统检测器：检测器分为溶质性检测器（只对流动相中的被分离分析组分的物理或物理化学性质有响应）和总体型检测器（对流动相的总的物理或

7、物理化学性质有响应）。（1）溶质性检测器：紫外（UVD）、荧光（FLD）、电化学（ECD）检测器等。紫外检测器—基于被测组分对特定波长的紫外光的选择性吸收，且吸收符合光吸收定律。因此可以进行定性定量分析。a．固定波长型检测器—是一种光源波长固定的紫外光度计，一般由低压汞灯作光源，发射波长为254nm波长的光。对在254nm波长附近有吸收的物质有响应。b．可变波长型检测器—是一台紫外可见分光光度计，波长任意可调。a.b.紫外检测器应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做

8、的很小（1mm×10mm，容积8μL）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。c.光电二极管阵列检测器（PDAD）一种新型记录方式的紫外检测器，紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器组成：它由光源、光栅、1024个二极管阵列（各检测特定波长），计算机。光源发射的光被组分选择性吸收，经光栅分光后照射到二极管阵列上，使每纳米光波的光强变成相应的电信号，经累积和计算机处理后得到试样或每个组分的吸收光谱。可以获得t、A、λ的三维