第二讲 电镜生物样品制备技术ppt课件.ppt

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1、第二讲电镜生物样品制备技术重庆医科大学电镜室罗子国9/18/20211常规电镜不能直接观察活体组织标本，必须对标本进行处理；因此样品制备是电镜技术中一个非常重要的组成部分，是电镜室技术工作中最繁重的环节。电镜样品制备技术是学习细胞超微结构的基础，换句话讲，要学习掌握好细胞超微结构知识及应用电镜技术进行研究工作，必须首先了解电镜的标本制备技术，故属于本课程的重点内容。9/18/20212第一部分常规透射电镜样品制备技术超薄切片（ultrathin-section）制备过程示意图：9/18/20213（一）、组织处理目的：将样品制备为包埋块，使细胞、组织具有适当的

2、切割性，以便制备超薄切片。1、取材(1)、要求：防止各种原因应起的离体或脱离正常生活环境后的超微结构。变化。(2）、要点：操作迅速熟练、取材位置9/18/202149/18/20215准确、快、小、利、净、冷，并注意做好标记。（3）、实验动物取材与临床活检取材的区别2、固定（1）、目的：尽可能的使组织保存接近生命状态的结构。9/18/20216（2）、方法：物理方法、化学方法(化学方法是最常用的方法)（3）、理想的固定液与良好的固定标准：理想的固定液应具备的条件：A、穿透力强B、能稳定细胞的结构和化学成分C、将细胞内的成分变为不溶状态D、灭活细胞内的酶活性E、

3、增强图像的反差良好固定的形态学标准：9/18/20217（4）、影响固定的因素固定液的pH值、渗透压、浓度、用量及固定的时间、温度等。（5）、常用固定剂a、四氧化锇（Osmiumtetroxide，OsO4）；又称锇酸，是电镜生物样品使用最广泛的固定剂，兼有电子染色作用，可作单固定，一般不用于电镜细胞化学实验的固定。对糖原和核酸的保护作用差。多用于后固定。b、戊二醛（glutaraldehyde，C5H8O2）；不能单独作为电镜样品固定液，对脂肪的保护作用差。没有“电子染色”的作用，通常用于前固定。c、甲醛（formaldehyde）。电镜多用多聚甲醛，对酶活

4、性保存好，可与戊二醛混合或单独用于细胞化学灌流固定或作为前固定液。9/18/202189/18/20219(6)、固定方式:浸泡固定法：体内原位固定法：灌流固定法：3、漂洗：目的：除去残留的固定液。9/18/2021104、脱水：（1）、目的：让不溶于水的包埋剂能浸透入组织和细胞里去。（2）、方法（3）、注意事项5、浸透（1）、目的：置换出脱水剂。（2）、方法：半浸透纯浸透9/18/2021116、包埋目的：有利于制备超薄切片（1）、包埋剂（2）、方法常规包埋定向包埋（二）、半薄切片1、半薄切片观察的目的和意义2、半薄切片的主要步骤修块、切片、染色、定位9/1

5、8/202112（三）、超薄切片（600埃左右）（1）、超薄切片的准备工作修块、定位、制刀、制膜（2）、超薄切片装块、装刀、对刀、加水、切片、捞片。9/18/2021139/18/2021149/18/2021159/18/2021169/18/2021179/18/202118（四）、染色1、什么是电子染色？2、为什么要进行电子染色？3、常用染料4、方法5、注意事项9/18/2021199/18/202120第二部分透射电镜特殊制样1、负染　利用高密度无结构的重金属物质把生物标本包绕起来。这种反差是负像（与正染色的超薄切片相比较）。最常用的染色剂是磷钨酸钠（

6、phosphotungsticacid，PTA），此法常用于病毒、蛋白分子或细胞亚单位的分子结构研究，制样简单，可作快速诊断。9/18/2021212、电镜细胞化学技术（electronmicroscopiccytochemistry）在保持细胞超微结构完整的条件下，借助细胞中的化学反应，研究细胞乃至细胞器的结构与功能的关系，是与化学、生物化学及免疫学有密切联系的一门学科。广义的电镜细胞化学研究方法主要有细胞超微标记示踪技术、电镜酶细胞化学技术和电镜免疫细胞化学技术（简称免疫电镜技术）等几种。9/18/202122（1）、电镜酶细胞化学术(electronmi

7、croscopiccytochemistryofenzymeorultracytochemistryofenzyme)基本原理及内容:酶细胞化学术（enzymecytochemistry）是利用酶催化反应特点，从亚微结构上研究酶的分布和活性。按其催化反应的性质可分为水解酶、氧化还原酶、转移酶、裂解酶、合成酶和异构酶六大类，应用较多的有水解酶和氧化还原酶。现以水解酶为例，介绍此技术的主要过程和基本原理。初级反应：底物被磷酸水解酶作用后分解产生磷酸。底物磷酸水解酶H3PO4最终反应：磷酸与金属捕捉剂结合形成反应产物。H3PO4捕捉剂（如Pb2+）Pb3(PO4)2

8、↓反应产物为电子致密的沉淀物，电镜下易