扫描电镜样品制备.ppt

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1、实验十一扫描电镜样品制备选作扫描电镜即扫描电子显微镜（ScanningElectronMicroscope，简称SEM）。主要用于观察样品的表面形貌、割裂面结构、管腔内表面的结构等。一、扫描电镜工作原理：主要是利用样品表面产生的二次电子成像来对物质的表面结构进行研究，是探索微观世界的有力工具。主要优点：景深长，所获得的图像立体感强，可用来观察生物样品的各种形貌特征。二、实验用品材料植物的的根、茎、叶或动物的脏器等。2.试剂丙酮、乙醇、2％戊二醛溶液、1％锇酸、0.1mol/LPH7.2磷酸缓冲液、醋酸异戊酯、液体二氧化碳、导电胶等。3.器材扫描电镜、临界点干燥法、真空喷镀仪、青霉素

2、小瓶、培养皿、载玻片、牙签、脱脂棉等。三、扫描电镜样品的制备●取样：将取下的动植物组织放入预冷的含有2％戊二醛溶液的载玻片上，用刀片将组织块切成长4mm左右、高3mm左右的小块。2.样品的清洁：把载玻片上切好的样品快，用牙签轻轻地逐个拨入盛有0.1mol/LPH7.2磷酸缓冲液的青霉素小瓶中漂洗，并反复更换用于清洗的缓冲液，一般漂洗1小时，换液3-4次。3.样品的固定样品的固定、漂洗和脱水等处理所用的试剂和方法基本上与透射电镜的样品相同，但由于扫描电镜观察的是样品的表面，主要是要求保持样品表面的原貌，因此，在固定、漂洗和脱水过程也与透射电镜样品处理有不同之处。一般在4℃的条件下完成

3、固定比较好，戊二醛、锇酸均可单独固定，也可用“戊二醛-锇酸”双重固定法。固定1-3小时（依样品种类和固定剂而已）后，吸出固定液，加入0.1mol/LPH7.2磷酸缓冲液，漂洗1小时，换液3-4次。4.脱水从小瓶中吸出缓冲液，加入乙醇逐级梯度脱水，脱水剂的乙醇浓度依次为30%－50%－70%－80%－90%－100%乙醇（两次）逐级脱水；样品在每级停留15-30分钟。5.置换乙醇吸出乙醇，加入醋酸异戊酯与乙醇1：1的混合液，浸泡10-20分钟并适当摇动，再吸弃混合液，加入纯醋酸异戊酯浸泡10-20分钟并适当摇动。6.样品的干燥常规临界点干燥法。临界点干燥法临界点干燥法是一种消除了物相

4、界面(液相／气相)，也就是消除了表面张力来源的干燥方法。这种方法由于没有表面张力的影响，所以样品不易收缩和损伤。具体处理步骤如下：装样：将样品从醋酸异戊酯中挑入(或倒入)样品笼中，用滤纸吸去样品笼外围的醋酸异戊酯，然后连笼移入仪器的样品杯(高压容器)内，盖上盖并拧紧以防漏气。(注：在装样前，应先打开仪器电源，将温度调节设定在0℃处预冷10～15min，以保证液态二氧化碳有足够量进入样品杯中)。注入液体二氧化碳依次打开二氧化碳钢瓶排气阀和仪器的进气阀在0～10℃下，向样品杯注入液体二氧化碳。当液体二氧化碳充至样品杯容积的50％(通过刻度尺观察，以液面超过样品笼为度)时，关闭仪器进气阀

5、，静置15～20min，让醋酸异戊酯向液态二氧化碳中充分扩散，然后，打开仪器排气流量计阀门和进气阀门，让其边排气边充液10min左右，(让含有醋酸异戊酯的二氧化碳排出和充入新鲜的液态二氧化碳)再关闭排气阀；继续充入液体二氧化碳至样品杯的80％左右，关闭进液阀，停止充液。加温置换：将温度调节设定在20℃处经15～20min后，由于温度升高，杯内液体二氧化碳逐渐气化，因此，压力也随之上升至7000Pa左右，样品中的醋酸异戊酯将与二氧化碳充分置换。气化：将温度旋钮调至临界温度以上(35～40℃)，此时随着温度升高，样品杯内的压力也逐渐增加，达到二氧化碳的临介点，界面也随之消失。当压力达到

6、7134Pa时，经5min后，即可排气。排气：在保持温度不变的条件下(即不关电源)，打开流量计的排气阀门，以1.0～1.51／min的速度排气(速度慢些更好)。约经45～60min后，排气完毕，样品杯的压力下降到零，将温度调节至室温约5rain后，即可取出样品装台镀膜(若不能立即装台，应置于干燥器内保存)。临界点干燥操作时的注意事项：在样品放进样品杯前，样品杯应预先冷却至0～10℃。样品不宜过湿，但也不能让其表面干涸，应在半干半湿时送入样品杯。因为过湿表明乙酸异戊脂太多会干燥后样品仍含有乙酸异戊脂，影响干燥效果。而过干又会因空气干燥而造成样品己变形，再进行临介点干燥也没有意义了。一

7、次加入的样品不宜过多，以免带进过多的中间液，使样品干燥不完全，另外，样品过多使二氧化碳量充入不足而达不到临界点。充入液体二氧化碳的量要足。因为充液量不足，达不到临界值，起不到临界点干燥作用，一般充液量应达样品杯容积的2/3左右。在加温气化时，实际操作温度应超过临界值，以保证达到充分的临界状态。"开"、"闭"阀门时，动作要轻缓，尽量防止二氧化碳液对样品产生突然冲击而造成样品损伤。因此，样品笼的上下应垫上一层镜头纸或滤纸。排气速度也应尽量缓慢，一般放气时间应在．4Omin