《电镜样品的制备》PPT课件

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1、第五章扫描电镜生物样品制备技术常规电镜样品要求：必须是干燥的，不含水分或可挥发性物质；具有一定机械强度，能耐受电子束轰击；具有导电性，被激发时能够产生足够的二次电子。生物材料特点：含水分多，质地柔软，机械强度小；组成元素的原子序数低，导电性差，激发后二次电子的产额较少。制样的任务：通过一系列处理，既要尽量完美地保存材料的固有形态，又要改良其物理性能，使其适合在电镜下观察成像。主要内容：第一节SEM样品的常规制备技术第二节特殊要求的扫描制样技术第一节扫描电镜样品的常规制备技术冷冻断裂粘样或滴样熏蒸固定干燥花粉

2、、种子及孢子类样品管道铸型腔形器官取材清洗固定脱水干燥粘样镀膜镜检清洗菌类和组培细胞取材清洗固定脱水干燥粘样镀膜镜检一、取材即：获取观察材料。遵循五字原则：准、轻、小、净、浓1.迅速准确：取材动作要快，部位要准确。方法：因材料而异，通过破碎、解剖、切割、分离、提纯等手段，获取样品最佳观察面。2.动作轻巧：保护好拟观察面。解剖器械要锋利，不能对材料施加锯、挤、拉压的外力。含水分多的、幼嫩材料最好冷冻断裂法。3.厚度小：满足观察条件的最小体积，厚度为1~2毫米4.纯净防混杂：花粉、孢子类样品注意防尘、防混杂5.

3、悬浮液样品要求合适的浓度：浓度太大造成样品堆积；浓度小则检出困难。取材清洗固定脱水干燥粘样镀膜镜检二清洗：确保得到清洁的观察表面1.完整的制样程序中有三次清洗固定前清洗：洗去表面的灰尘、黏液等附着物，确保获得清洁的观察表面。前固定后清洗：洗净醛类固定液，以免戊二醛与锇酸反应而削弱锇酸的固定效果。脱水前的清洗：洗净固定液，以免固定液与脱水剂反应而产生沉淀，影响观察效果。2.清洗液的类型与选择：蒸馏水、生理盐水、加酶清洗液等选择原则：清洗液的pH值、渗透压、温度应该尽量接近样品的生理值，以免样品因环境突变而导致

4、形态变化。植物材料：蒸馏水洗净尘埃；动物材料：等渗生理盐水、5%碳酸钠或缓冲液洗去黏液等；游离细胞：用等渗的缓冲液清洗(精子、血细胞、微生物)；覆盖大量黏液的样品(胃黏膜)用低浓度的蛋白水解酶溶液洗；组织培养细胞：用相应的培养液清洗；特殊样品：如乳腺组织富含蛋白质和脂类，分别用16%的甘油和20%乙醇浸泡清洗；表面附着蜡质、角质层的样品：用有机溶剂脱蜡。选择方法：取材清洗固定脱水干燥粘样镀膜镜检取材清洗固定脱水干燥粘样镀膜镜检3.清洗方法：不同材料采用不同方法，灵活应用（1）植物材料：根部用水冲洗去泥土，植

5、株用水冲洗或滴洗。观察气孔状态时应注意清洗后取材时机。（2）较干净的样品：固定后20倍体积的清洗液轻摇，换液三次。（3）表面附着大量黏液的样品：振荡法或喷射瓶壁加压冲洗。（4）游离细胞、微生物：离心法清洗。（5）超声波清洗：用于表面结构复杂、凹陷、皱折多的样品。样品置清洗液中，超声波清洗器内清洗，必须控制功率（6）灌流清洗：观察管腔内壁结构的样品，避免血液、组织液凝聚而影响观察效果。通过动脉注入清洗液，直到排出液变清为止。必须控制压力清洗液与样品混合摇匀低速离心（反复三次）取材清洗固定脱水干燥粘样镀膜镜检1

6、.单固定：只用一种固定剂（通常戊二醛）固定的方法。2.熏蒸固定：固体培养基上培养的菌丝类样品，用锇酸（或甲醛）蒸汽熏蒸固定0.5~1小时。3.双固定：戊二醛(1~3h)—锇酸(0.5~1h)4.冷冻固定：液氮超低温快速冷冻可保存样品的生活状态。5.不固定：干种子、花粉、孢子类、毛发类样品。四、脱水：梯度系列脱水法。注意：根据材料性质和大小而调节脱水时间。三、固定方法取材清洗固定脱水干燥粘样镀膜镜检五、干燥：指除去样品中的残存液体（水或脱水剂），使样品中不含液态物质的过程。原因：液态物质脱离样品表面时必须克服

7、表面张力，其反作用力会使样品表面结构产生形变。1.自然干燥法：样品中的水分或脱水剂在大气中自然蒸发使样品干燥。适宜样品：花粉、孢子、种子、果壳、木质纤维、骨骼；游离细胞类在脱水剂中自然干燥较好。特点：经济便捷。2.真空干燥法：含水分或脱水剂样品置于真空干燥器内，抽低真空使液态物质挥发，使样品干燥。特点：干燥速度快，效果与自然干燥法相近。3.冷冻干燥法：超低温快速冷冻取材固定脱水制冷剂真空升华粘样液氮、丙烷取材清洗固定脱水干燥粘样镀膜镜检样品干燥法4.临界点干燥法（criticalpiontdryingmet

8、hodCPD)(1)干燥原理：在密闭容器中加热，使液态干燥剂变为气态，当气态与液态物质的密度相等时，相界消失。这时液态干燥剂的分子内聚力为零，此时液体的表面张力系数为零(即临界状态)。在临界状态下继续对容器加热，同时以一定速度排出气体（保持临界状态），直到排净为止。这时样品在无表面张力影响的临界状况下得以干燥。使干燥剂气相与液相相等的温度称为该干燥剂的临界温度。使干燥剂气相与液相相等的气压称为该干燥剂的临界压强。