第八章基因工程和基因组学ppt课件.ppt

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1、第八章基因工程和基因组学第一节基因工程第二节基因组学1谢爱林第一节基因工程基因工程概述限制性内切核酸酶载体基因的分离与鉴定基因工程的应用2谢爱林基因工程概述★遗传工程一般可分为广义和狭义的两种。广义的遗传工程包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程等。狭义的遗传工程即是通常讲的基因工程。本节只介绍基因工程。★基因工程中的DNA重组主要是指创造自然界中没有的DNA分子的新组合。这种重组不同于经典遗传学中经过遗传交换产生的重组。基因工程是采用分子生物学、核酸生物化学以及微生物遗传学的现代方法和手段建立起来的基因操作技术

2、。3谢爱林★从细胞和组织中分离DNA。★利用能识别特异DNA序列的限制性内切核酸酶(restrictionendonucleases)酶切DNA分子，制备DNA片段。★将酶切的DNA片段与载体DNA连接，构建重组DNA分子。★将载体与DNA片段构成的重组DNA分子导入宿主细胞后，该重组DNA分子能在细胞内复制，产生多个完全相同的拷贝，即克隆(clones)。★重组DNA能随宿主细胞的分裂而分配到子细胞，使子代群体细胞均具有重组DNA分子的拷贝。★能从宿主细胞中回收、纯化和分析克隆的重组DNA分子。★克隆的DNA

3、能转录成mRNA、翻译成蛋白质。能分离、鉴定基因产物。一基因工程概述4谢爱林目的基因的获得目的基因与载体的连接成重组DNA分子重组DNA分子导入受体细胞筛选重组克隆基因表达与产物分离基因工程的内容一基因工程概述5谢爱林重组DNA技术一基因工程概述6谢爱林二限制性内切核酸酶★限制性内切核酸酶或限制性酶(restrictionenzymes)是细菌中这些酶的功能是降解外来DNA分子的一类酶。以限制(restriction)或阻止病毒侵染。★限制性酶据其作用特点，可分为两类。※第Ⅰ类限制性酶每隔一段DNA序列随机

4、切割双链DNA分子，没有序列特异性。※第Ⅱ类限制性酶能识别一段特异的DNA序列，准确地酶切双链DNA的特异序列。第Ⅱ类限制性酶识别的序列是对称的，即在一条链中从5’到3’方向的序列，与其互补链从5’到3’方向的序列完全相同。这种从两个方向阅读而序列相同的序列称为回纹对称序列(palindrome)。7谢爱林二限制性内切核酸酶8谢爱林二限制性内切核酸酶9谢爱林10谢爱林三载体一个DNA片段只有与适合的载体(vector)DNA连接构成重组DNA后，在载体DNA的运载下，才可以高效率地进入宿主细胞(hostcell

5、)，并在其中复制、扩增、克隆出多个拷贝。可作为DNA载体的有质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母菌人工染色体（BAC、YAC）等。作为载体DNA分子，需要具备以下四个条件：★具复制原点(ori)，在宿主细胞中不仅能独立地自我复制，而且能带动携带的外源DNA片段一起复制，★具有多克隆位点(multiplecloningsite,MCS)，而每一种酶的切点只有一个，用于克隆外源DNA片段。这些酶切位点不存在于复制原点或抗性选择标记基因内。★至少具有一个选择标记基因，使有或无载体的宿主细胞具有易鉴别的表型。★易从宿主细胞中

6、回收。11谢爱林1.细菌质粒◆质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、能自我复制、易分离和导入的环状双链DNA分子。☆这些质粒的适应范围广，拷贝数多。进入宿主细胞复制后，每个细胞的质粒拷贝数可高达1000个。◆早期用于基因工程的载体是经遗传改良的细菌质粒，它们仅能用于克隆分子量小于10kb(1000bp=1kb)的外源DNA片段。☆现在广泛使用且商品化的质粒，很多都具有重组表型检测标记，在DNA克隆中根据宿主细胞的表型即可推知质粒是否携带外源DNA片段。12谢爱林2.λ噬菌体◆λ噬菌体基因组全长49kb。

7、λ噬菌体DNA中间约三分之二的序列为中间基因簇(centralgenecluster)，位于两端的为DNA左、右臂。λ基因组的中间基因簇序列可被外源DNA片段取代,而不影响噬菌体感染细菌及形成噬菌斑的能力。◆λ噬菌体载体可接受15kb-23kb的外源DNA片段，它既可作为克隆载体，也可作为表达载体，在基因库筛选中，λ噬菌体作载体与细菌质粒相比，具有易操作、阳性克隆数多等特点，现广泛用于各类基因库的构建。13谢爱林3.柯斯质粒◆柯斯质粒(cosmid)是利用部分λ噬菌体DNA与部分细菌质粒DNA序列组建而成的(图

8、9－5)。柯斯质粒具有λ噬菌体的cos序列(12bp)和细菌质粒的复制原点。cos序列是噬菌体DNA包装成噬菌体时所必需的，而质粒的复制原点可使柯斯质粒在细菌细胞中同普通细菌质粒一样自主复制。柯斯质粒也具有抗生素抗性基因◆可接受长达50kb的外源DNA片段，这在克隆真核生物基因中十分有用，因为一个DNA片段就可能具有真核生物基因的编码序列及其它调控序列。还与YAC克隆系统结合，用于基因