第九章 基因工程和基因组学.ppt

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1、第九章基因工程和基因组学第一节基因工程遗传工程广义：细胞工程、染色体工程细胞器工程、基因工程狭义：基因工程一、基因工程概述基因工程是20世纪70年代初随着DNA重组技术的发展应运而生的一门新技术。→1982年经美国食品及药物管理局批准，采用基因工程方法在细菌中表达生产的人的胰岛素进入市场，成为基因工程产品直接造福于人类的首例→1985年转基因植物获得成功→1996年克隆羊诞生。→现在，人类已利用这一技术改造和创建新的生命形态、生产药品、疫苗、牛奶和食品，诊断和治疗遗传疾病。1.从细胞和组织中分离DNA。2.利用限制性内切核酸酶酶切DNA分子，

2、制备DNA片段。3.将酶切的DNA片段与载体DNA连接，构建重组DNA分子。4.将重组DNA分子导入宿主细胞后，在细胞内复制，产生克隆(clones)。5.重组DNA能随宿主细胞的分裂而分配到子细胞，使子代群体细胞均具有重组DNA分子。6.能从宿主细胞中回收、纯化和分析克隆的重组DNA分子。7.克隆的DNA能转录成mRNA、翻译成蛋白质。能分离、鉴定基因产物。二、限制性内切核酸酶限制酶：作用于特定（异）核苷酸序列的磷酸二脂酶，是遗传工程的工具酶目前已分离和鉴定出200多种不同的限制酶限制性酶据其作用特点可分为两类:第Ⅰ类:每隔一段DNA序列随

3、机切割双链DNA分子，没有序列特异性。很少在基因工程中应用。第Ⅱ类:能识别一段特异的DNA序列，准确地酶切双链DNA的特异序列。基因工程中广泛应用。图9－1限制性内切酶EcoRI的酶切位点及酶切产物连接回纹序列图9－2限制性内切酶SmaI的识别及酶切位点平齐末端三、载体经限制性酶酶切的DNA片段或基因，必需与适合的载体DNA连接构成重组DNA后，才可以高效率地进入宿主细胞，并在其中复制、扩增、克隆可作为DNA载体的有质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母菌人工染色体BAC、YAC等作为载体，需具备4个条件：1.具复制原点，在宿主细胞中能独立复制，能带

4、动携带的外源DNA片段复制。2.具有多克隆位点，即具有多种限制酶切点，每一种酶的切点只有一个，用于克隆外源DNA片段。3.至少具有一个选择标记基因，这个基因是抗菌素的抗性基因或某种酶的基因，而宿主细胞则没有这种基因，使有或无载体的宿主细胞具有易鉴别的表型。4.易从宿主细胞中回收。1、细菌质粒：广泛应用于基因工程2、噬菌体载体1、噬菌体；2、噬菌体DNA；3、噬菌体DNA中间基因簇；4、将连接物体外包装后感染细菌，制备基因库（用于基因库构建）3、柯斯质粒：是利用部分λ噬菌体DNA与部分细菌质粒DNA序列组建而成的，它可接受长达50kb的

5、外源DNA片段，在克隆真核生物基因中十分有用4、穿梭质粒：能在两种不同的生物中复制的载体。例如既能在原核生物(如大肠杆菌)中复制，又能在真核细胞(如酵母)中复制的载体。很多酵母菌的穿梭载体，用于功能互补法分离、鉴定真核生物基因的研究5、细菌人工染色体：上述的几种载体都不能携带大于50kb的外源DNA片段，而很多真核生物基因长度在50kb以上。细菌人工染色体(BAC)载体就是为克隆更大的外源DNA片段而设计构建的6、酵母菌人工染色体：YAC可接受100-1000kb的外源DNA片段，这一特点使YAC成为人类基因组计划及图位克隆分离基因的重要工具

6、7、Ti质粒及其衍生载体Ti质粒包括五个区域，1.LB与RB之间的T-DNA，这段序列整合到植物基因组中；2.质粒转移区(PT)；3.冠瘿碱代谢区；4.复制原点；5.毒性区。→T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所以将致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed)后，将细菌抗生素的抗性基因或其它序列插入到这个区域，形成的T-DNA仍可将RB至LB内的序列转移并整合到植物基因组。→Vir区的毒性基因是T-DNA转移所必需的，毒性基因可以顺式及反式两种方式控制T-DNA转移。Ti质粒是约200-500kb的环状DNA分子，很难直接使用，故需对其加以

7、改造，构建出Ti质粒的衍生载体系统，广泛用作植物基因工程中的载体：（1）双元载体(binaryvectors）如pBin19载体，具有原核生物的卡那霉素抗性基因(AphⅠ)作为细菌选择标记，真核生物的卡那霉素抗性基因(nos-NptⅡ)作为植物的选择标记，pUC19的多克隆位点及α-互补显色标记（2）共整合载体(integratedvectors)四、基因的分离与鉴定一个基因就是编码一条多肽链的一个DNA片段，包括启动子、终止子及内含子。利用DNA重组技术，可从一个含有10万个基因的大基因组中，准确地分离出特异的单个目的基因。分离与鉴定基因是

8、DNA重组中的关键步骤之一。1、从基因库中分离基因基因库(library)是一组DNA和cDNA序列克隆的集合体。从基因库中分离基因，首先要构建基因库。（1）构建基