第九章基因工程和基因组学ppt课件.ppt

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1、第九章基因工程和基因组学第一节基因工程一、基因工程概述基因工程的概念：按照既定的目的和方案，把目的基因片段与载体DNA连接形成重组DNA分子，然后将其导入宿主细胞，并对含有目的基因的细胞进行克隆，最后利用克隆的基因表达、制备蛋白质或多肽，或定向改造细胞乃至生物个体。这种技术方法称为基因工程。基因工程的基本过程：目的基因的制备载体的制备目的基因与载体的连接重组DNA分子导入宿主细胞含目的基因细胞的筛选和鉴定基因工程（geneengineering）也称为遗传工程（geneticengineering）、基因操作（genemanipulation）、ＤＮＡ重

2、组技术（recombinationDNAtechniques）。有时人们还称它为基因克隆（genecloning）或分子克隆（molecularcloning）。DNA重组：不同来源的DNA分子通过磷酸二酯键连接而形成重新组合的DNA分子的过程，称为DNA重组（DNArecombination）。基因工程概述基因工程概述工具酶限制性内切核酸酶DNA聚合酶Ⅰ（Klenow片段）逆转录酶T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端脱氧核苷酰转移酶TaqDNA聚合酶和其它耐热DNA聚合酶修饰酶二限制性内切核酸酶1、限制性内切核酸酶的命名：命名规则：用来源细菌的英文缩写斜体符

3、号命名。它的第一个字母大写，代表细菌的属名；第二、三字母小写，代表细菌的种名；第四个字母代表菌株；最后用罗马字母表示同一菌株中不同限制酶的编号。名称属名种名株名序号菌株来源EcoRⅠEcoRⅠEscherichiacoliRHindⅢHindⅢHaemophilusinfluenzaedHindⅡHindⅡHaemophilusinfluenzaedHpaⅠHpa/ⅠHaemophilusparainfluenzae2、限制性酶分类.Ⅰ限制酶：通常在识别位点下游100~1000bp处切割DNA，切割位点难以预测。每隔一段DNA序列随机切断双连DNA分子,

4、没有序列特异性.Ⅱ限制酶：在识别位点切割DNA，切割位点固定，序列可知。Ⅲ限制酶：在识别位点附近切割DNA，切割位点难以预测。第Ⅱ类限制性酶能识别一段特异的DNA序列,准确地酶切双链DNA的特异序列（回纹对称序列）.从两个方向阅读序列相同的序列称为回纹对称序列5’—GAATTC—3’5’—GAATTC—3’3’—CTTAAG—5’3’—CTTAAG—5’3、切割方式：交错切割DNA双链,产生两个相同的单链黏性末端(stickyend)；平齐切割DNA双链,产生两个相同的单链平齐末端。例如：5’—GAATTC—3’5’—GAATTC—3’3’—CTTAAG

5、—5’3’—CTTAAG—5’5‘—G5’--AATTC—3’3’—CTTAAG—5’5’--CCCGGG—3’3’—GGGCCC—5’5’--CCCGGG—3’3’—GGGCCC—5’末端转移酶（terminaltransferase）该酶全称为末端脱氧核苷酸转移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase），它所催化的反应与DNApolI相似，所不同的是它不需要模板，它可以含有３’－ＯＨ的ＤＮＡ片段为引物，在３’－ＯＨ端加入核苷酸达几百个。末端转移酶常用于在平头ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性末端。ＤＮＡ连接酶

6、（DNAligase）该酶常从Ｔ４噬菌体的受感细胞中提取，是由Ｔ４噬菌体基因组所编码的，所以基因工程中常用的连接酶是Ｔ４连接酶。它可催化ＤＮＡ中磷酸二脂键的形成，从而使两个片段以共价键的形式结合起来。DNA连接酶对具有粘性末端的DNA分子能很好地连接，对平末端的DNA分子也可以进行连接，但连接效率较低，必须加大酶的用量。连接酶限制酶反转录酶（reversetranscriptase）这类酶来自于反转录病毒，它可以ＲＮＡ为模板，催化合成ＤＮＡ。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）反转录酶两种。三、载体（vector）载体克隆载体表达载体质粒噬

7、菌体粘性质粒M13噬菌体大肠杆菌表载体酵母菌表达载体哺乳动物表达载体①具复制原点(ori),在宿主细胞中不仅能独立地自我复制,而且能带动携带的外源DNA片段一起复制.②具有多个克隆位点(multiplecloningsite,MCS,或称polylinkerregion),即具有多种限制性酶的切点,而每一种酶的切点只有一个,用于克隆外源DNA片段.这些酶切位点不存在于复制原点或抗性选择标记基因内,以保持载体的自主复制特性及表型标记性状.③至少具有一个选择标记基因,这个基因通常是抗菌素的抗性基因或某种酶的基因,而宿主细胞则没有这种基因,使有或无载体的宿主细

8、胞具有易鉴别的表型.④易从宿主细胞中回收.载体需要具备以下4个条件:（一）质粒（