逆境生理指标的测定.doc

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1、逆境生理指标的测定要求：选三个指标一、植物组织中超氧物歧化酶活性的测定催化下列反应：2+2H+→H2O2+O2反应产物H2O2可被过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。因此SOD有保护生物体免受活性氧伤害的能力。已知此酶活力与植物抗逆性及衰老有密切关系，故成为植物逆境生理学的重要研究对象。原理本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有可被氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生，可将氮蓝四唑还原为蓝色的化合物，蓝色化合物在5

2、60nm处有最大吸收，而SOD可清除从而抑制了蓝色化合物的形成。因此光还原反应后，反应液蓝色愈深说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。试剂0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）；130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml；750μmol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml避光保存；100μmol/LEDTA-Na2溶液：取0.03721gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml；20μmol

3、/L核黄素溶液：取0.00753g核黄素用磷酸缓冲液定容至1000ml避光保存(当天配制)。方法　　1、酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加1ml磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。取2~3ml于10000rpm下离心10分钟，上清液即为SOD粗提液。2、显色反应取5ml试管（或指形管，要求透明度好）7支，3支试管为测定管，另4支为对照管，按表1加入各溶液。混匀后将1支对照管置暗处，其他各管置于4000lx日光灯下反应20min（要求各管受光情况一

4、致，反应室的温度高时反应时间可以缩短，温度低时反应时间可适当延长(温度范围30~37℃)。表1各溶液加入量试剂（酶）用量(ml)终浓度（比色时）0.05mol/L磷酸缓冲液130mmol/LMet溶液750μmol/LNBT溶液100μmol/LEDTA-Na2液20μmol/L核黄素酶液蒸馏水1.50.30.30.30.30.10.213mmol75μmol10μmol2.0μmol对照管加缓冲液代替酶液总体积3.03、蛋白浓度的计算蛋白浓度＝单位：mg蛋白/g样重c－通过标准曲线查得的每管中蛋白含量

5、（mg）v－样液总体积（ml）a－测定时提取液体积用量（ml）W－样重（g）4、SOD活性测定与计算至反应结束后，以不照光的对照管作空白，在560nm下分别测定其它各管的光密度值，SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示。按下式计算SOD活性。SOD总活性=单位：酶单位/g鲜重表示；Ack―照光对照管的光密度值；AE—样品管的光密度值；V—样液总体积（ml）；a—测定时样品用量（ml）；W—样重（g）；二、氧自由基的测定原理：与羟胺反应生成NO2-，NO2-在对氨基苯磺酸和α-萘胺

6、作用下，生成粉红色的偶氮染料，染料在λ530nm有显著吸收，根据OD530可以算出样品中的含量。步骤：1、酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加1ml磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。取2~3ml于10000rpm下离心10分钟，上清液即为SOD粗提液。2亚硝酸根标准曲线的制作：1ml系列浓度的NaNO2(0、5、10、15、20、30、40和50mmol /L)分别加入lm1对氨基苯磺酸和lmlα-萘胺，于25℃中保温20min，然后测定OD55

7、0，以[NO2-]和测得的OD530值互为函数作图，制得亚硝酸根标准曲线。3O2-含量测定：0.5m1样品提取液中加入0.5m150mmo1/L磷酸缓冲液(pH7.8)，1m1的1mmo1／L盐酸羟胺，摇匀，于25℃中保温lh，然后再加人lm117mmo1/L对氨基苯磺酸(以冰醋酸：水＝3：1配制)和1m1　7mmol/Lα-萘胺(以冰醋酸：水＝3：1配制)，混合，于25℃中保温20min，取出以分光光度计测定波长530nm的OD值。   根据测得的OD530，查NO2—标准曲线，将OD530换算成[N

8、O2-]，然后依照羟胺与　　的反应式：NH2OH十2O2十H+  NO2-十H2O2十H2O从[NO2-]对[O2]进行化学计量，即将 [NO2-]乘以2，得到[O2]根据记录样品与羟胺反应的时间和样品中的蛋白质含量，可求得产生速率(nmo1min-1mg-1蛋白)。三、植物体内游离脯氨酸含量的测定植物在正常条件下，游离脯氨酸含量很低，但遇到干旱、低温、盐碱等逆境时，游离脯氨酸便会大量积累，并且积累指数与植物的抗逆性有关。因此，脯氨酸可作为