各生理指标的测定方法

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1、各生理指标的测定方法一、脯氨酸含量的测定1.茚三酮法1.1原理在正常环境条件下，植物体内游离脯氨酸含量较低，但在逆境（干旱、低温、高温、盐渍等）及植物衰老时，植物体内游离脯氨酸含量可增加10-100倍，并且游离脯氨酸积累量与逆境程度、植物的抗逆性有关。用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色，从标准曲线上查出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。1.2步骤试剂：（1）25%茚三酮：茚三酮---------

2、---0.625g冰乙酸------------15ml6mol/L磷酸--------10ml70°C水浴助溶；（2）6mol/L磷酸：85%磷酸稀释至原体积的2.3倍；（3）3%磺基水杨酸：磺基水杨酸------3g加蒸馏水至------100ml实验步骤：（1）称取0.1g样品放入研钵，加5ml3%磺基水杨酸研磨成匀浆，100°C沸水浴15min；（2）冰上冷却，4000rpm离心10min；（3）提取液2ml+冰醋酸2ml+25%茚三酮2ml混合均匀，100°C沸水浴30min，冰上冷却；（4）加4ml甲苯混合均匀，震荡30s，静置30min；（

3、5）以甲苯为空白对照，再520nm下测定吸光值。1.3计算方法脯氨酸含量（μg/gFW）＝X*提取液总量（ml）/样品鲜重（g）*测定时提取液用量（ml）*10^6公式中：X-----从标准曲线中查得的脯氨酸含量（μg）提取液总量---------------------------5ml测定时提取液用量---------------------2ml问题及质疑：1.酸性体系下，脯氨酸与茚三酮加热反应后的最终产物为红色，再实验过程中，仅有少数时候能发现红色产物。原因有待确定。2.经查看文献资料，反应步骤已经是优化的，没有问题。甲苯萃取脯氨酸与茚三酮的反应

4、产物，消除了多余未反应的茚三酮，磺基水杨酸，提取液中其他杂质（如色素）以及PH变化的干扰。3.根据茚三酮与脯氨酸的缩合反应分析：（1）反应体系的PH控制很重要，保持酸性环境，否则，反应产物的最大吸光值并不在520nm。（2）极限干旱材料或者重脱水材料的脯氨酸含量大，材料干重比新鲜材料多数倍，加相同量的茚三酮，反应程度应该有所不同。而脯氨酸含量少的样本，容易受到各种因素的干扰。二、丙二醛含量的测定1.原理植物在逆境下遭受伤害（或衰老）与活性氧积累诱发的膜脂过氧化作用密切相关，膜脂过氧化的产物有二烯轭合物、脂类过氧化物、丙二醛、乙烷等。其中丙二醛（MDA）是

5、膜脂过氧化最重要的产物之一，因此可通过测定MDA了解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。丙二醛在高温及酸性环境下可与2-硫代巴比妥酸（TBA）反应产生红棕色的产物3,5,5´-三甲基恶唑2,4-二酮（三甲川），该物质在532nm处有一吸收高峰，并且在660nm处有较小光吸收。由于醛、可溶性糖对此反应有干扰，在450nm处有一吸收峰，用双组分分光光度法加以排除。2.步骤试剂：（1）10%三氯乙酸（TCA）：TCA--------------25g加ddH2O至---------250ml（2）0.6%硫代巴比妥（TBA）：TBA--

6、----------0.6g加5%TCA至---------100ml实验步骤：（1）称取材料0.1g，加10%TCA2ml研磨至匀浆，再加8ml进一步研磨；（2）4000rpm离心10min，取上清至新管；（3）2ml提取液+2ml0.6%TBA，混合均匀，2mlddH2O+2ml0.6%TBA为空白对照；（4）混合沸水浴15min，冰上冷却；（5）4000rpm离心10min；（6）取上清再532nm，600nm，450nm波长下的光密度值。1.计算方法式中，Vt：提取液总体积（mL）----------------10ml；Vs：测定用提取液体积（

7、ml）-------------2ml；FW：样品鲜重（g）---------------------0.1g。注意事项：1．可溶性糖与TBA显色反应的产物在532nm也有吸收（最大吸收在450nm），当植物处于极度干旱时可溶性糖含量会增高，必要时要排除可溶性糖的干扰。2．低浓度的铁离子能增强MDA与TBA的显色反应，当植物组织中铁离子浓度过低时应补充Fe3+（最终浓度为0.5nmol·L-1）3．如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间，最好使用低温离心机离心。三、过氧化氢酶的活性测定——高锰酸钾滴定法【原理】过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它

8、能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂