各生理指标的测定方法

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时间:2018-01-22

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1、各生理指标的测定方法一、脯氨酸含量的测定1.茚三酮法1.1原理在正常环境条件下,植物体内游离脯氨酸含量较低,但在逆境(干旱、低温、高温、盐渍等)及植物衰老时,植物体内游离脯氨酸含量可增加10-100倍,并且游离脯氨酸积累量与逆境程度、植物的抗逆性有关。用磺基水杨酸提取植物样品时,脯氨酸游离于磺基水杨酸的溶液中,然后用酸性茚三酮加热处理后,溶液即成红色,再用甲苯处理,则色素全部转移至甲苯中,色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色,从标准曲线上查出(或用回归方程计算)脯氨酸的含量。1.2步骤试剂:(

2、1)25%茚三酮:茚三酮------------0.625g冰乙酸------------15ml6mol/L磷酸--------10ml70°C水浴助溶;(2)6mol/L磷酸:85%磷酸稀释至原体积的2.3倍;(3)3%磺基水杨酸:磺基水杨酸------3g加蒸馏水至------100ml实验步骤:(1)称取0.1g样品放入研钵,加5ml3%磺基水杨酸研磨成匀浆,100°C沸水浴15min;(2)冰上冷却,4000rpm离心10min;(3)提取液2ml+冰醋酸2ml+25%茚三酮2ml混合均匀,100°C沸

3、水浴30min,冰上冷却;(4)加4ml甲苯混合均匀,震荡30s,静置30min;(5)以甲苯为空白对照,再520nm下测定吸光值。1.3计算方法脯氨酸含量(μg/gFW)=X*提取液总量(ml)/样品鲜重(g)*测定时提取液用量(ml)*10^6公式中:X-----从标准曲线中查得的脯氨酸含量(μg)提取液总量---------------------------5ml测定时提取液用量---------------------2ml问题及质疑:1.酸性体系下,脯氨酸与茚三酮加热反应后的最终产物为红色,再实验过程

4、中,仅有少数时候能发现红色产物。原因有待确定。2.经查看文献资料,反应步骤已经是优化的,没有问题。甲苯萃取脯氨酸与茚三酮的反应产物,消除了多余未反应的茚三酮,磺基水杨酸,提取液中其他杂质(如色素)以及PH变化的干扰。3.根据茚三酮与脯氨酸的缩合反应分析:(1)反应体系的PH控制很重要,保持酸性环境,否则,反应产物的最大吸光值并不在520nm。(2)极限干旱材料或者重脱水材料的脯氨酸含量大,材料干重比新鲜材料多数倍,加相同量的茚三酮,反应程度应该有所不同。而脯氨酸含量少的样本,容易受到各种因素的干扰。二、丙二醛含量

5、的测定1.原理植物在逆境下遭受伤害(或衰老)与活性氧积累诱发的膜脂过氧化作用密切相关,膜脂过氧化的产物有二烯轭合物、脂类过氧化物、丙二醛、乙烷等。其中丙二醛(MDA)是膜脂过氧化最重要的产物之一,因此可通过测定MDA了解膜脂过氧化的程度,以间接测定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。丙二醛在高温及酸性环境下可与2-硫代巴比妥酸(TBA)反应产生红棕色的产物3,5,5´-三甲基恶唑2,4-二酮(三甲川),该物质在532nm处有一吸收高峰,并且在660nm处有较小光吸收。由于醛、可溶性糖对此反应有干扰,在450nm处有一

6、吸收峰,用双组分分光光度法加以排除。2.步骤试剂:(1)10%三氯乙酸(TCA):TCA--------------25g加ddH2O至---------250ml(2)0.6%硫代巴比妥(TBA):TBA------------0.6g加5%TCA至---------100ml实验步骤:(1)称取材料0.1g,加10%TCA2ml研磨至匀浆,再加8ml进一步研磨;(2)4000rpm离心10min,取上清至新管;(3)2ml提取液+2ml0.6%TBA,混合均匀,2mlddH2O+2ml0.6%TBA为空白对照

7、;(4)混合沸水浴15min,冰上冷却;(5)4000rpm离心10min;(6)取上清再532nm,600nm,450nm波长下的光密度值。1.计算方法式中,Vt:提取液总体积(mL)----------------10ml;Vs:测定用提取液体积(ml)-------------2ml;FW:样品鲜重(g)---------------------0.1g。注意事项:1.可溶性糖与TBA显色反应的产物在532nm也有吸收(最大吸收在450nm),当植物处于极度干旱时可溶性糖含量会增高,必要时要排除可溶性糖的干

8、扰。2.低浓度的铁离子能增强MDA与TBA的显色反应,当植物组织中铁离子浓度过低时应补充Fe3+(最终浓度为0.5nmol·L-1)3.如待测液浑浊,可适当增加离心力及时间,最好使用低温离心机离心。三、过氧化氢酶的活性测定——高锰酸钾滴定法【原理】过氧化氢酶(CAT)属于血红蛋白酶,含有铁,它能催化过氧化氢分解为水和分子氧,在此过程中起传递电子的作用,过氧化氢则既是氧化剂

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