研究生ELISA的原理与应用.ppt

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1、酶免疫技术广州医科大学金域检验学院徐霞标记免疫技术=抗原抗体反应示踪物标记灵敏性特异性标记免疫技术的主要特点：高特异性、高灵敏性免疫技术+标记技术标记免疫技术免疫测定技术免疫组化技术示踪物及标记技术酶免疫技术荧光免疫技术放射免疫技术化学发光技术金免疫技术生物素-亲和素免疫放大技术……酶免疫技术基本原理利用酶催化底物反应的生物放大作用,提高特异性抗原-抗体免疫学反应的检测敏感性的一种标记免疫技术。基本特点：①标记后保留酶和抗原(抗体)的活性。②酶促反应专一性，保证特异性。③底物反应放大作用，提高敏感性。④酶标试剂保存稳定。⑤操作简便，安全易行。酶免疫组化用于

2、检测组织切片或细胞涂片中的抗原和抗体酶免疫技术均相酶免疫测定酶免疫测定固相酶免疫测定异相酶免疫测定（ELISA）液相酶免疫测定酶的选择要求：活性高专一性好易与抗原、抗体偶联底物易得、易保存无毒害产物易测量酶与底物成本价廉优点(与其他酶比较)分子量较小标记方法简单较稳定溶解性好价格较低底物种类多HRP催化反应：DH2+H2O2D+2H2O过氧化物(受氢体）：H2O2供氢体：OPD、TMB常用的酶及底物----辣根过氧化物酶(HRP)主酶是糖蛋白(275nm)，无活性，辅基亚铁血红素(403nm)，有活性纯度(RZ)=403nm/275nm>3.0酶活性单位：

3、1min将1umol底物转化为产物所需的酶量HRP常用底物邻苯二胺（OPD）:反应后显橙黄色，酸终止后呈棕黄色,最大吸收峰275nm。灵敏度高，比色方便。但配成应用液后稳定性差,显色过程需避光，且有致变异性.四甲基联苯胺（TMB）:反应后显蓝色，目测鲜明，酸终止后呈黄色，最大吸收峰450nm.稳定性好，显色过程无需避光，无致变异性.碱性磷酸酶（AP）：是一种磷酸酯的水解酶，不易透入细胞内，但因其敏感性高，空白值低，也较常用。底物常用的有对-硝基苯磷酸酯(PNP)，产物为黄色的硝基酚，测定波长为405nm。ß-半乳糖苷酶（ß-Gal）：来源于大肠埃希氏菌，不

4、受内源性酶干扰，底物为4-甲基伞形酮--D-半乳糖苷，产物为高强度荧光物4-甲基伞形酮，敏感性较HRP者高30-50倍，测量时需用荧光计。酶标记物的制备一般要求技术方法简单、标记效率高、重复性好标记反应易控制，标记后不改变活性酶标记物较稳定，不聚合改良过碘酸钠标记法只适用于HRP过碘酸钠将HRP分子表面的多糖羟基氧化为醛基，醛基可与抗体蛋白的游离氨基结合形成HRP-CH2-NH-IgG复合物再用硼氢化钠还原（终止反应）优点是产率高戊二醛交联标记法以双功能交联剂戊二醛(活性醛基)为桥一步法：简便易行，交联时反应物分子间比例不易控制二步法：酶和抗体分步与戊二

5、醛交联，先用过量的戊二醛与酶作用，使戊二醛上的活性醛基先与酶蛋白上的一个氨基结合，再加入抗体反应。酶标记物质量较均一，标记效率较高酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)(一)基本原理：使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性（固相抗原／抗体的形成）在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应（抗原抗体反应）※用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。（酶标

6、抗原抗体复合物的分离）※加入底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。（显色反应）（二）ELISA技术类型：ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体，在这种测定方法中有3种必要的试剂：固相的抗原或抗体即"免疫吸附剂"（immunosorbent）酶标记的抗原或抗体称为“结合物”（conjugate）酶作用的底物。1．双抗体夹心法固相载体抗体抗原酶抗体酶标记抗体1.将抗体包被在固相载体上。2.如样品中含有抗原，则结合为抗原抗体复合物。3.再加入酶标记抗体，则结合为抗体-抗原-酶标记抗体

7、复合物。4.酶催化底物并显色。双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法特点：※非竞争结合反应※常用于抗原的检测※适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测※所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的不同抗原决定簇2．间接法酶抗抗体酶标记抗抗体抗体抗原固相载体1.将抗原包被在固相载体上。2.如样品中含有抗体，则结合为抗原抗体复合物。3.再加入酶标记抗抗体（抗IgG），则结合为抗原-抗体-酶标记抗抗体复合物。4.酶催化底物并显色。间接法测抗体间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体(酶标抗人IgG)建立检测相应抗体的方法。易受血清中

8、高浓度非特异性IgG的干扰，待测标本需稀释后测定。1.将抗原包被在