ELISA原理.ppt

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1、ELISA知识简介六和集团质检中心2010-6-26ELISA的发展历程ELISA的原理ELISA的类型ELISA的试剂准备ELISA操作注意事项一、ELISA的发展历程免疫酶标记技术是继免疫荧光抗体技术和放射免疫分析之后发展起来的一大新型的血清学技术。1966年，Nakane和Avrameas等分别报道用酶代替荧光素标记抗体，建立了酶标抗体技术（enzyme-labelledantibodytechnique），用于生物组织中抗原的定位和鉴定。1971年，Engvall，VanWeemen等报道了酶联免疫吸附试验，从而建立了

2、酶标抗体的定量检测技术。20世纪80年代，酶标记抗体检测和鉴定蛋白质分子的免疫转印技术问世，目前，免疫酶标记技术已成为免疫诊断、检测和分子生物学研究中应用最广泛的免疫学方法之一。二、ELISA的原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合的一种敏感性很高的实验技术。基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留其酶的活性。测定时，受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应，洗涤加入酶标记抗原

3、或抗体，加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。免疫酶标记类型免疫酶标记免疫酶标测定固相免疫酶测定免疫酶组化均相免疫酶测定液相免疫酶测定非均相免疫酶测定均相EIA可不需进行游离的和结合的标记物的分离而直接测定标记物。均相EIA在临床检验中较少应用。非均相EIA需先进行游离的和结合的标记物的分离。这种固相免疫酶测定方法在1971年最初建立时称为酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay），简称ELISA。1.1抗原抗体反应1.

4、1.1可逆性抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：Ag+Ab→Ag·Ab抗体的亲和力可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab],Ag·Ab的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。1.1.2特异性抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。1.1.3最适比例1.1.4敏感性化学比色法

5、的敏感度为mg/ml水平酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/ml免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平例如，HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml。1.4免疫测定在临床检验中的应用由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原，尤其采用基因工程方法制备包被抗原来检测样本中的相应抗体，都大大提高了ELISA的特异性，加之电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用，使ELISA更为简便实用和标准化，从

6、而使其成为最广泛应用的检测方法之一。综上，由于ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用。三、ELISA的类型ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂"（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物”（conjugate）；（3）酶反应的底物。可设计出各种不同类型的检测方法。双抗体夹心法示意图固相载体抗体抗原酶抗体酶标记抗体1.将抗体包被在固相载体上。2.如样品中含有抗原，则结合为抗原抗体复合

7、物。3.再加入酶标记抗体，则结合为抗体-抗原-酶标记抗体复合物。4.酶催化底物并显色。双抗原夹心法示意图1.将抗原包被在固相载体上。2.如样品中含有抗体，则结合为抗原抗体复合物。3.再加入酶标记抗原，则结合为抗原-抗体-酶标记抗原复合物。4.酶催化底物并显色。酶抗原酶标记抗原抗体抗原固相载体酶抗抗体酶标记抗抗体抗体抗原固相载体1.将抗原包被在固相载体上。2.如样品中含有抗体，则结合为抗原抗体复合物。3.再加入酶标记抗抗体，则结合为抗原-抗体-酶标记抗抗体复合物。4.酶催化底物并显色。间接法示意图捕捉法示意图酶抗体酶标记抗体抗原

8、抗抗体固相载体抗体1.将抗抗体包被在固相载体上。2.如样品中含有抗体，则结合为抗抗体-抗体复合物。3.加入抗原及酶标记抗体，则结合为抗抗体-抗体-抗原-酶标记抗体复合物。4.酶催化底物并显色。酶标抗原竞争法示意图固相载体抗体抗原酶酶标记抗原1.将抗体包被在固相载体上。2.如样