ELISA原理.ppt

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1、ELISA原理基本原理它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。一、ELISA原理二、ELISA的类型ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂"（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物”（conjugate）；（3）酶反应的底物。可设计出各种不同类型的检测方法。酶抗抗体酶标记抗抗体抗体抗原固相载体1.将抗原包被在固相载体上。2.加入含抗体的样品，结合为抗原抗体复合

2、物。3.再加入酶标记抗抗体，则结合为抗原-抗体-酶标记抗抗体复合物。4.酶底物催化显色。间接法三、生物素-亲合素放大技术亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。固相上先预包被链霉亲合素，原用包被固相的抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗原固相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使抗原的结合点充分暴露。封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液

3、再包被的过程。抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。四、注意事项加样:在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。温度抗原抗体完成反应的温度应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。洗涤洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。清除残留在板

4、孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。对照设定阳性对照品(positivecontrol)和阴性对照品(negativecontrol)是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照。阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。加入的量应与试剂的敏感度相称；在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可以估计标本物质的量。显色显色是酶催化无色的底物生成有色产物

5、的温育反应。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。比色拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪中。Phaget梯度标准曲线的范围一般较宽，曲线的值逐点连接，所得曲线一般呈S形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。