elisa的原理与应用

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1、酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）技术讲座安徽省动物疫病预防与控制中心王非2009年9月16日一、免疫检测的基础知识二、ELISA的基本知识三、本次ELISA实验操作解读主要内容1抗原抗原是能在机体中引起特异性免疫应答的物质。抗原进入机体后，可刺激机体引起细胞免疫和产生抗体。能在机体中引起抗体产生的抗原多为分子量大于5000的蛋白质，例如完整的病毒粒子、细菌等。小分子化合物在与大分子蛋白质结合后能引起机体产生特异性抗体的，称为半抗原。例如某

2、些激素、药物等。抗原的反应性取决于抗原决定簇，或称为表位。一个抗原分子可带有不同的决定簇，例如细菌的荚膜多糖、类脂中可带有多个抗原决定簇。2抗体抗体的结构抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig分五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。与免疫测定有关的Ig主要为IgG和IgM。Ig由两个轻链（L）和两个重链（H）的单体组成。Ig的轻链是相同的，有κ（kappa）和λ（Lambda）两种型别。五类Ig的重链结构不同，这决定了它们的抗原性也不同。IgG和Ig

3、M的重链分别称为γ（gamma）链和μ（mu）链。重链和轻链的N端的氨基酸排列顺序因各种抗体而异，称为可变区，分别用VH和VL表示。两者构成抗体的抗原结合部位，只与相应的抗原决定簇匹配，发生特异性结合（见图），是抗体专一性结合抗原的结构基础。机体被微生物感染后，先产生IgM抗体，然后产生IgG抗体。经过一段时间，IgM抗体量逐渐减少而消失，而IgG抗体可长期存在，在疾病痊愈后可持续数年之久。1.1抗原抗体反应1.1.1可逆性抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：Ag+Ab→

4、Ag·Ab抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab],Ag·Ab的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。1.1.2特异性抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。1.1.3最适比例在恒定量的抗体中加入递增量的抗原形成抗体复合物（沉淀）的量见图。曲线

5、的高峰部分是抗原抗体比例最合适的范围，称为等价带。在等价带前后分别为抗体过剩带和抗原过剩带。如果抗原或抗体极度过剩，则无沉淀物形成，在免疫测定中称为带现象。抗体过量称为前带，抗原地过量称为后带。在用免疫学方法测定抗原时，应使反应系统中有足够的抗体量，否则测得的量会小于实际含量，甚至出现假阴性。1.1.4敏感性化学比色法的敏感度为mg/ml水平酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/ml免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平例如：用放射免疫测定法或

6、酶免疫测定法测定口蹄疫抗体，其敏感度可达0.1ng/ml。1.2免疫测定在临床检验中的应用由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原，因此免疫测定的应用范围极广。1)体液中的各种蛋白质，包括含量极少的蛋白质。2)激素，包括小分子量的甾体激素等。3)抗生素和药物。4)病原体抗原，如胶体金测禽流感病毒。5)另外，也可利用纯化的抗原检测标本中的抗体。免疫标记技术定义：将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素标记

7、的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。分类：放射免疫测定法：131I，32P免疫荧光技术：FITC，PE免疫酶测定法：HRP，AP免疫酶测定法(EnzymeImmunoAssay,EIA)用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)特点：高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值分类：酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体酶免疫组化法：组织中或细胞表面的抗原。酶标

8、抗体技术酶分子与抗原或抗体分子共价结合酶标抗体与存在于组织细胞或吸附于固相载体上的抗原（抗体）发生特异性结合，并洗下未结合的物质。滴加底物溶液后，底物在酶作用下水解呈色。可根据颜色反应来判定有无相应的免疫反应。颜色反应的深浅与标本中相应抗原（抗体）的量成正比。此种有色产物可用肉眼或分光光度计加以测定。酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方