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1、总糖的测定:苯酚硫酸法2008-12-0622:38:00作者:来源:互联网浏览次数:758文字大小:【大】【中】【小】苯酚-硫酸法测定总糖[原理]多糖在硫酸的作用下先水解成单糖,并迅速脱水生成糖醛衍生物,然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。[试剂]1.浓硫酸:分析纯,95.5%2.80%苯酚:80克苯酚(分析纯重蒸馏试剂)加20克水使之溶解,可置冰箱中避光长期储存。3.6%苯酚:临用前以80%苯酚配制。(每次测定均需现配)4.标准葡聚糖(Dextran,瑞典Pharmacia),或分析纯葡萄糖。5.15%三氯乙酸(15%TCA):15克TCA加85克水使之溶解,可置冰箱中长期储存。
2、6.5%三氯乙酸(5%TCA):25克TCA加475克水使之溶解,可置冰箱中长期储存。7.6mol/L氢氧化钠:120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。8.6mol/L盐酸[操作]1.制作标准曲线:准确称取标准葡聚糖(或葡萄糖)20mg于500ml容量瓶中,加水至刻度,分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸馏水补至2.0ml,然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却,室温放置20分钟以后于490nm测光密度,以2.0ml水按同样显色操作为空白,横坐标为多糖微克数,纵坐标为光密度值,得标准曲线。2.样品含量测定:①取样品1克(湿样)加1
3、ml15%TCA溶液研磨,再加少许5%TCA溶液研磨,倒上清液于10毫升离心管中,再加少许5%TCA溶液研磨,倒上清液,重复3次。最后一次将残渣一起到入离心管。注意:总的溶液不要超出10毫升。(既不要超出离心管的容量)。②离心,转速3000转/分钟,共三次。第一次15分钟,取上清液。后两次各5分钟取上清液到25毫升锥形比色管中。最后滤液保持18毫升左右。(测肝胰腺样品时,每次取上清液时应过滤。因为其脂肪含量大容易夹带残渣。)③水浴,在向比色管中加入2毫升6mol/L盐酸之后摇匀,在96℃水浴锅中水浴2小时。④定容取样。水浴后,用流水冷却后加入2毫升6mol/L氢氧化钠摇匀。定容至25毫升的容
4、量瓶中。吸取0.2ml的样品液,以蒸馏补至2.0ml,然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却室温放置20分钟以后于490nm测光密度。每次测定取双样对照。以标准曲线计算多糖含量。[注意]测定时根据光密度值确定取样的量。光密度值最好在0.1——0.3之间。比如:小于0.1之下可以考虑取样品时取2克,仍取0.2ml样品液,如大于0.3可以减半取0.1ml的样品液测定。
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