重组体分子的选择与鉴定方法及鉴定课件.ppt

《重组体分子的选择与鉴定方法及鉴定课件.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、重组体分子的选择与鉴定方法及原理重组体分子的选择与鉴定方法我们把外源基因导入受体细胞的目的是获得带有目的基因阳性重组体，因而重组体的筛选是体外重组技术的一个重要环节。涂布菌液，观察平板是无法判断重组子是否是我们所需的。因此，我们需要进一步进行筛选。常用的筛选方法概括起来有两大类：①直接筛选法；②间接筛选法。直接筛选法直接筛选法是借助遗传学表型来进行筛选的方法。重组子转化宿主细胞后，载体上的一些筛选标志基因表达，会导致宿主的某些表型的改变，通过琼脂平板中添加相应筛选物质，可以直接筛选含重组子的菌落。如果质粒上有两种抗性，因

2、为外源基因的插入，导致其中一个不能表达，那么也可以通过抗药性将重组子筛选出来。间接筛选法间接筛选法是检测重组体克隆中是否含有目的基因的核苷酸序列或是否产生目的基因所编码的产物。一般来说，先用直接筛选法进行初步筛选后，再用间接检测法进行鉴定，直至获得我们所需要的阳性重组体。DNA水平RNA水平蛋白质水平遗传表型直接筛选法核酸分子杂交法PCR法DNA序列分析法直接凝胶电泳法酶切片段分析法重组子筛选检测特定外源基因是否转录及转录的强度（Northern杂交印迹法)免疫化学检测法（放射性抗体检测法、免疫沉淀检测法）Westher

3、n印迹杂交法重组子筛选的方法重点介绍的筛选方法间接选择法抗药性筛选a互补快速裂解菌落鉴定分子大小限制性内切酶酶切法PCR方法筛选鉴定重组子遗传表型直接选择法菌落杂交筛选遗传学表型筛选的方法之一——抗药性筛选基本原理抗药性筛选主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选。因为质粒DNA携带有特定的抗药性选择标记基因，与目的基因重组后，转入受体菌，能使受体菌带有相应抗药性，另一种情况是虽然质粒中原来有相应抗性，但插入外源片段后重组质粒失去抗药性，据此我们也可以进行抗药性筛选。常用的抗药性选择标记抗药性溶解剂虑过除菌贮存温度贮存浓

4、度终浓度氨苄青霉素（Amp）氯霉素（Cm）水乙醇是否-20℃-20℃50mg/ml34mg/ml50~100µg/ml20~170µg/ml卡那霉素（Ka或Kan）水是-20℃10mg/ml50µg/ml四环素（Tet或Tc）乙醇否-20℃12.5mg/ml10µg/ml（液）12.5µg/ml（固）链霉素（Sm或Str）水是-20℃20mg/ml25µg/mlA如果外源基因片段插入载体的位点在抗药性基之外，不导致抗药性基因的失活，仍能编码抗药性基因产物。含有这种重组子的转化细胞可以在含有相应抗生素的琼脂平板上生长成菌落

5、，未能接受载体DNA的细胞因不能生长而被排除。b：如果外源基因片段插入载体的位点在抗药性基因中间，导致抗药性基因失活，这个抗药性标志就会失活。检测外源DNA插入作用的一种通用的方法是插人失活效应。a类筛选基本原理抗药性筛选主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选。因为重组质粒DNA携带有特定的抗药性选择标记基因，转化受体菌后能使后者在含有相应选择药物的选择培养基上生长，而不含重组质粒DNA分子的受体菌则不能存活。a类筛选的实验方法LB固体培养基中加入千分之一的抗性药物，再倒平板；将转化后的菌液均匀涂布在平板上；放在37℃

6、培养箱培养12~16小时；观察菌落生长情况。抗药性标记法示意图b类插入失活筛选从原理上讲，当外源基因(或DNA片段)插入到某一基因内的位点后,使这个基因丧失了原有的功能叫插入失活(insertionalinactivation)。插入失活法是从不同的重组DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子（筛选）的主要方法。例如：非重组的pBR322质粒DNA上的四环素和氨苄青霉素抗性基因都是正常的,表型为AprTcr。带有这种质粒的受体菌可以在加有四环素和氨苄青霉素的双抗性平板上生长。但是,如果在该质粒的氨苄青霉素抗性基

7、因内插入外源片段,就会造成氨苄青霉素抗性基因失活,变成ApsTcr,携带这种质粒的宿主菌可以在四环素的平板上生长,而不能在氨苄青霉素抗性平板上生长。B类插入失活筛选步骤注意事项：（1）以Amp、Tc等抗生素作为选择药物，37℃培养时间约12~16h，超过时间视为杂菌（假转化子菌落）。（2）挑选单菌落作为转化子以便进一步实验验证。挑的菌落在LB培养基中震荡培养。遗传学表型筛选的方法二—a互补基本原理：这种筛选方法适用于含b-半乳糖苷酶基因的载体。载体在b-半乳糖苷酶的a-肽编码区具有多克隆区域。重组质粒中的插入片段使a-肽

8、失活，可在指示平板上通过颜色筛选鉴别。不带有插入片段的载体表达有活力的b-半乳糖苷酶，所用的宿主菌在染色体或附加体上缺失掉LacZM15基因，导致内源a-肽失活。载体或其他含LacZ基因的a-肽互补细菌，具有b-半乳糖苷酶的w片段。所得到的活力b-半乳糖苷酶（a-肽加w片段）将底物X-Gal转化为有颜色的产物，得到蓝