离子交换层析法分离氨基酸课件.ppt

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1、实验三离子交换层析法分离氨基酸【实验目的】（1）学习采用离子交换树脂分离氨基酸的基本原理。（2）掌握离子交换柱层析法的基本操作技术。【实验原理】离子交换层析法主要是利用溶液中各种带电离子与离子交换剂之间的结合力的差异进行的分离方法。各种氨基酸分子的等电点不同，在同一pH时所带电荷不同，与离子交换树脂的结合力有差异，因此可依据结合力从小到大的顺序被洗脱液洗脱下来，达到分离的效果。离子交换剂为固定相。带电离子与离子交换剂之间的作用力主要是静电力，它们的结合是可逆的。离子交换剂由基质（惰性不溶性载体）、电荷基团（功能基团）和反离子（平衡离子）三部分组成。纤维素-O-CH2-

2、COO--Na+基质电荷基团反离子平衡离子带正电荷的为阳离子交换剂；平衡离子带负电荷的为阴离子交换剂。RA+B+RB+A+离子交换树脂是具有酸性或碱性基团的人工合成的聚苯乙烯-苯二乙烯等不溶性的高分子化合物。聚苯乙烯-苯二乙烯是由苯乙烯（单体）和苯二乙烯（交联剂）进行聚合和交联反应生成的具有网状结构的高聚物。它是离子交换树脂的基质，带电基团是通过后来的反应引入基质的，树脂一般都制成球形颗粒。—CH2—CH2—CH—CH2—CH2—CH—SO3——CH—CH2—CH2—CH—苯环—SO3—有氢型和钠型H+或Na+H+或Na+从交换剂上洗脱目的物的方法有两种：1.调节洗脱

3、液的pH，使目的物在此pH下失去电荷甚至带相反电荷。2.用高浓度的同性离子，将目的离子取代下来。【试剂和器材】苯乙烯磺酸钠型树脂（强酸1×8，100—200目）。2mol/L盐酸溶液；2mol/L氢氧化钠溶液。混合氨基酸溶液：天冬氨酸、赖氨酸溶液。柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液（pH5.8，钠离子浓度0.45mol/L）显色剂（茚三酮溶液）12cm×1cm层析管;蠕动泵;部分收集器；烘箱。【实验步骤】1.树脂的处理：碱-酸-碱将干的强酸型树脂用蒸馏水浸泡过夜，使之充分溶胀。用4倍体积的用2mol/L的氢氧化钠浸泡2小时，倾去清液，洗至中性，用2mol/L的盐酸浸泡1小时

4、，倾去清液，洗至中性。再用2mol/L的氢氧化钠处理，做法同上。最后用欲使用的缓冲液浸泡。2、装柱取直径1cm,长度10－12cm的层析柱。将柱垂直至于铁架上。自顶部注入上述经处理的树脂悬浮液，关闭层析柱出口，待树脂沉降后，放出过量溶液，再加入一些树脂，至树脂沉降至8~10cm的高度即可。3.平衡、加样用pH5.8的柠檬酸缓冲液冲洗平衡交换柱。调节流速为1mL/min，流出液达到床体积的2-3倍时即可上样。由柱上端仔细加入氨基酸的混合液0.5mL，同时开始收集流出液。当样品液弯月面靠近树脂顶端时，即刻加入0.5mL柠檬酸缓冲液冲洗加样品处。待缓冲液弯月面靠近树脂顶端时

5、，再加入0.5mL缓冲液。如此重复两次，4.洗脱并将柱与蠕动泵想和部分收集器相连。开始用试管收集洗脱液，每管收集1mL，共收集40—50管。5.检测用铅笔在滤纸上画上多个小圈并编号，用玻棒把分部收集仪上试管中的溶液滴一滴到滤纸上相应编号的小圈中，干后喷茚三酮溶液，烘箱加热显色。6.洗脱曲线以试管编号为横坐标，颜色深浅为纵坐标，作图。管号颜色123456