泡桐丛枝植原体pPaWBNy-2-ORF4编码蛋白的抗体制备和表达分析.pdf

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1、林业科学研究2013，26(4)：494～500ForestResearch文章编号：1001—1498(2013)04-0494-07泡桐丛枝植原体pPaWBNy一2·ORF4编码蛋白的抗体制备和表达分析耿显胜，田国忠，任争光，宋传生，林彩丽(中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所，国家林业局森林保护学重点实验室，北京100091)摘要：以感病泡桐组培苗提取的DNA为模板，采用PCR方法扩增pPaWBNy一2一ORF4的部分片段。将目的片段克隆到原核表达载体pGEx-4T一3，重组质粒pGEX．p2ORF4转化大肠杆菌Rosseta(DE3)菌

2、株。IPTG诱导表达，分子量约为38kDa的含GST标签的融合蛋白得到表达。切胶回收目的蛋白，免疫大白兔制备抗血清。间接ELISA测定抗血清的效价约为1：4096，免疫印迹实验显示：抗血清能够与原核表达的GST融合蛋白发生特异的免疫反应，与pPaWBNy一1一ORF5的原核表达蛋白无明显的交叉反应。利用制备的抗血清，在感病泡桐饲毒的茶翅蝽中检测到分子量约为18kDa的蛋白条带，而在无菌茶翅蝽和感病泡桐组培苗中均未检测到，表明pPaWBNy一2一ORF4在饲毒的茶翅蝽中表达，而在感病泡桐组培苗中未表达或表达量低于检测水平。据此推测，该基因参与茶翅蝽传播

3、泡桐丛枝植原体。关键词：茶翅蝽；多克隆抗体；昆虫传播；植原体中图分类号：$718．8文献标识码：APreparationofthePolyclonalAntibodyAgainstpPaWBNy-2一ORF4ofPaulowniaWitches’-broomPhytoplasmaandItsExpressionAnalysisGENGXian—sheng，TIANGuo—zhong，RENZheng—guang，SONGChuan—sheng，LINCai—li(ResearchInstituteofForestEcology，Environment

4、andProtection，KeyLaboratoryofForestProtectionofStateForestryAdministrationChineseAcademyofForestry，Beijing100091，China)Abstract：ThepPaWBNy一2-ORF4wasamplifiedfromgenomeDNAextractedfrominfectedpaulowniaplantletsbyPCR．TheamplifedDNAfragmentswereinsertedintotheprokaryoticexpression

5、vectorpGEX-4T-3．Therecombi—nantplasmidpGEX—p2ORF4wastransformedintotheEscherichiacoliRosseta(DE3)strain．The38kDaGST—taggedp2ORF4fusionproteinwasexpressedeficientlyinE．coliRosseta(DE3)inducedbyIPTG．Thefusionpro—teinwaspurifiedandinjectedintoarabbittoraiseantiserum．Thetiterofthea

6、ntiserumwas1：4096determinedbyindirectELISA．WesternblotanalysisshowedthattheobtainedpolyclonalantibodycouldreactwithGST．taggedp2ORF4proteinbuthadnoreactionwithpPaWBNy一1一ORF5proteinexpressedinE．coli．Westernblotanalysisalsorevealedaspecificl8kDaproteinbandinHalyomorphaha(Sta1)expo

7、suretoPaWB—infectedpaulownia，butnotinnon—infectedH．haSandPaWB—infectedpaulownia．ItwasinferredthatpPaWBNy-2一ORF4mightbeinvolvedinthetransmissionofH．has．Keywords：Halyomorphaha(Sta1)；polyclonalantibody；insecttransmission；phytoplasma收稿日期：2013-03-25基金项目：国家自然科学基金面上项目“泡桐丛枝植原体质粒蛋白p23及寄

8、主互作蛋白功能研究”(3117062)作者简介：耿显胜(1982一)，男，河南信阳人，博士，主要从事森林保护