SNT2482-2010马铃薯丛枝植原体检疫鉴定方法.pdf

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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２４８２—２０１０马铃薯丛枝植原体检疫鉴定方法犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳狆狅狋犪狋狅狑犻狋犮犺犲狊’犫狉狅狅犿狆犺狔狋狅狆犾犪狊犿犪２０１００１１０发布２０１００７１６实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜２４８２—２０１０前言本标准的附录Ａ和附录Ｂ均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院负责起草。本标准主要起草人：王秀芬、赵文军、刘伟、彭金火、牟海青、周铭、朱水芳

2、。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ标准分享网www.bzfxw.com免费下载犛犖／犜２４８２—２０１０马铃薯丛枝植原体检疫鉴定方法１范围本标准规定了马铃薯丛枝植原体的检疫鉴定方法。本标准适用于所有进境种薯、商品薯、组培苗和脱毒苗等马铃薯种质中马铃薯丛枝植原体的检疫鉴定。２原理２．１学名和分类地位学名：Ｐｏｔａｔｏｗｉｔｃｈｅｓ’ｂｒｏｏｍｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ缩写：ＰＷＢ分类地位：细菌界（Ｂａｃｔｅｒｉａ），硬壁菌门（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ），柔膜菌纲（Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ），非固醇菌原体目（Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓ

3、ｍａｔａｌｅｓ），非固醇菌原体科（Ａｅｈｏｌｅｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ），植原体属（犘犺狔狋狅狆犾犪狊犿犪），三叶草丛蔟组（Ｃｌｏｖｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｇｒｏｕｐ，１６ＳｒⅥ）。其他资料参见附录Ａ。２．２鉴定原理马铃薯丛枝植原体的分子生物学特性为本标准鉴定方法的主要依据。３仪器和用具３．１仪器设备：ＰＣＲ仪、超净工作台、电泳仪、凝胶成像分析仪、冷冻离心机、电子天平（１／１００００ｇ）、ｐＨ计、水浴锅、振荡器等。３．２用具；可调移液器（０μＬ～２０μＬ、２０μＬ～２００μＬ、２００μＬ～１０００μＬ）及相关吸头、研钵

4、、离心管（１．５ｍＬ、１０ｍＬ）、ＰＣＲ管（０．２ｍＬ）、量筒、烧杯、镊子等。４试剂４．１研磨液磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４）０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸二氢钠（ＮａＨ２ＰＯ４）０．０３ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ１０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．０）蔗糖１０％（质量浓度）ＰＶＰ４０２％（质量浓度）调整ｐＨ至７．６，然后过滤除菌。使用前加入０．１５％（质量浓度）牛血清白蛋白（ＢＳＡ）和１ｍｍｏｌ／Ｌ抗坏血酸维生素Ｃ。４．２犆犜犃犅缓冲液ＣＴＡＢ２％（质量浓度）ＴｒｉｓＨＣｌ１００ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．０）ＥＤＴＡ２０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．０）氯化钠

5、（ＮａＣｌ）１．４ｍｏｌ／ＬＰＶＰ４０１％（质量浓度）１犛犖／犜２４８２—２０１０４．３其他试剂苯酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙醇、琼脂糖、溴化乙锭、犜犪狇ＤＮＡ聚合酶、１０×ＰＣＲ缓冲液、ｄＮＴＰ液（２．５ｍｍｏｌ／ＬｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ）。５检疫鉴定５．１犇犖犃提取大约０．３ｇ组织（叶柄、叶脉、茎）在３ｍＬ预冷研磨液中研磨，将粗汁液转移至２ｍＬ微量离心管中。４℃下４５００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ。将悬浮液转至新的２ｍＬ离心管中。４℃下１３０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ。去掉上清液。在７５０μＬ预热（５

6、５℃）ＣＴＡＢ缓冲液中悬浮沉淀［少量ＣＴＡＢ缓冲液（如１００μＬ）更易悬浮沉淀，然后加入剩余的ＣＴＡＢ缓冲液（如６５０μＬ）］。５５℃下孵育３０ｍｉｎ，间歇颠倒混匀。离心管在冰上冷却３０ｓ。加入７５０μＬ三氯甲烷∶异戊醇（２４∶１体积比），涡旋振荡。４℃或室温下１３０００ｒ／ｍｉｎ离心４ｍｉｎ。小心将上面水相转至一个新的１．５ｍＬ离心管中。加入１体积预冷异丙醇，涡旋振荡。冰上孵育４ｍｉｎ后４℃或室温下１３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ。去掉上清液。用５００μＬ７０％（体积分数）冷乙醇洗涤ＤＮＡ沉淀，４℃或室温下１３０００ｒ／

7、ｍｉｎ离心１ｍｉｎ。空气干燥ＤＮＡ沉淀。用２０μＬ灭菌蒸馏水悬浮沉淀。５５℃下孵育离心管１０ｍｉｎ有助于ＤＮＡ再悬浮。－２０℃短期贮存或－８０℃长期贮存。注：也可采用商品试剂盒提取。５．２引物序列引物采用植原体１６ＳｒＤＮＡ（参见附录Ｂ）通用引物Ｐ１／Ｐ７和Ｒ１６Ｆ２ｎ／Ｒ１６Ｒ２。引物序列见表１。表１犘犆犚检测的引物www.bzfxw.com引物名称引物序列５’３’产物／ｂｐＰ１ＡＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧＧＡＴＴ１８００Ｐ７ＣＧＴＣＣＴＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＴＴ通用引物Ｒ１６Ｆ２ｎＡＣＧＡＣＴＧＣＴＡＡＧＡ

8、ＣＴＧＧ１２５１Ｒ１６Ｒ２ＴＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣＡＡＡＣＣＣＣＧ５．３巢式犘犆犚用引物Ｐ１／Ｐ７进行第１轮ＰＣＲ。反应体系见表２。反应条件为：９４℃／５ｍｉｎ；９４℃／３０ｓ，５３℃／３０ｓ，７２℃／１ｍｉｎ，３５个循环；７２℃／１０ｍｉｎ。表２犘犆犚反应体系试剂名称加样量／μ