肝细胞复合体的低温保存实验研究.pdf

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1、33卷4期中国生物医学工程学报V01．33No．4August20142014年8月ChineseJournalofBiomedicalEngineering肝细胞复合体的低温保存实验研究杨波刘宝林李娟沈力(上海理工大学医疗器械与食品学院，上海200093)摘要：探索微载体cytodex3与细胞结合的复合体低温保存的可行性。以cytodex3为支架体系，细胞类型采用贴壁细胞肝细胞，观察低温保存对细胞复合体的影响，包括低温保存对微载体Cytodex3支架性能的影响，以及复合体复温后细胞与微载体的黏附存活率、细胞功能指标的代谢情况。实验结果表明，肝细胞复合体低温保存2周后，微载

2、体上的细胞活性与单独细胞冻存相比无显著差异，能够正常生存并保持增殖和产物分泌能力。细胞与载体黏附培养细胞密度大，细胞生物活性高，低温保存复苏后肝细胞功能良好，可用于构建生物人工肝。关键词：肝细胞；细胞复合体；低温保存；代谢指标中图分类号TB661文献标志码D文章编号0258—8021f2014)04-0503-05ExperimentalonCryOpreserVati0nofLiverCompositeYANGBoLIUBao-LinLIJuanSHENLi(SchoolofMedicalInstrumentandFoodEngineering，UniversityofS

3、hanghaiforScience＆Technology，Shanghai200093，China)Keywords：bepatocytes；livercompositecryopreservation；metabolism会引起细胞从载体上脱落。复合体需要低温保存引言的不仅是悬浮的肝细胞，更主要是细胞和细胞与细低温冻存是保存细胞和其他组织的重要方法，胞和材料的整体结构，只有黏附于载体上处于生理而有效大量地保存肝细胞和培养细胞的三维结构形态的细胞，才能继续分化增殖并发挥肝细胞的功对生物性人工肝的研究有重要作用。。微载体能。因此，低温保存是否会影响肝细胞在微载体Cytodex

4、3近年来被用于大量培养各种细胞，而培养上的黏附分化增殖及肝细胞的代谢功能，是本研究出的众多细胞如何冻存则方法各异。微载体低温目的。下面探讨本方法是否能够良好地保持细胞保存，传统的方法是从微载体上收获细胞，再将收的生存率和功能，并与单独肝细胞冻存方法进行比获的细胞进行低温保存，这种方法有很大缺陷，因较，讨论冻存后对微载体Cytodex3的影响，并对低为从微载体上收获细胞，一般会损失10％～30％的温保存复合体细胞的可行性进行论证。总细胞量，严重影响细胞的低温保存数量“。因1材料与方法此，本实验将对培养达到一定数量的微载体肝细胞采用细胞复合体整体低温保存。1．1实验仪器目前，细

5、胞材料复合体及生物组织保存方法都实验所用的HL-02肝细胞购于上海细胞生物是悬浮细胞低温保存方法的经验性延伸，但悬研究所，cytodex3微载体(球径133～215m，浮细胞与细胞材料复合物在形态结构方面还存在Pharmasia，瑞典)、葡萄糖试剂盒等购于上海索莱宝一定的差异。一方面，低温保存物的体积增大，造生物科技有限公司。实验仪器有二氧化碳培养箱成在低温保存过程中低温保护剂的渗人不均匀；另(上海博讯实业有限公司，中国)、立式压力蒸汽灭一方面，细胞与材料之间由于收缩系数不同，可能菌器(Tommy有限公司，日本)、Nikon显微镜doi：10．3969／j．issn．025

6、8~021．2014．04．017收稿日期：2014-03-O5，录用日期：2014-05-23基金项目：国家自然科学基金(51076108)通信作者(Correspondingauthor)，E-mail：yangbo6899@126．com中国生物医学工程学报(ECLIPSE55i，尼康，日本)等，还有场发射环境扫描1．3．3测定肝细胞在cytodex．3上的增殖情况电子显微镜(QuantaFEG，FEI公司，美国)。先对肝细胞微载体复苏培养0、2、4、6、8、10d，1．2肝细胞微载体的培养再分别对其进行MTT值的测定。将肝细胞微载体将处理过的微载体加到已硅化六孔培养

7、板中，复合物置于6孔培养板中诱导培养，每隔2d各取4同时接种L-02肝细胞悬液(2×10cells／mL)，每瓶份细胞材料复合物，采用MTT比色法测定细胞在材加培养液5mL，放置于培养箱。料上的增殖情况，共测10d。1．3肝细胞微载体与细胞的低温保存和复温实验步骤：1)在无菌台上，先将6孔板中培养4d或6d的1)从6孔板与培养瓶中搜集细胞，调整细胞悬肝细胞微载体上的清液用移液枪吸弃，再把肝细胞液浓度分于96孔板，每孔180IxL。微载体吸到低温保存管中。2)置于37~C、5％CO的培养箱中培养，使细胞2)将配置的两