角膜低温保存过程的研究

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1、大连理工大学硕士学位论文角膜低温保存过程的研究姓名：丁来福申请学位级别：硕士专业：化学工程指导教师：马学虎20070601大连理工大学硕士学位论文摘要低温保存技术是一种长期保存角膜的方法，它不仅能为临床提供新鲜角膜，同时也为眼库提供一种长期保存角膜的方法。角膜低温保存的关键是保持角膜内皮细胞层的完整性和功能正常。因为角膜内皮细胞层对于保持角膜的厚度、透明度和脱水状态起着至关重要的作用。角膜的低温保存技术主要有两种形式：慢速冷冻法和玻璃化法。角膜的低温保存通常采用慢速冷冻法，但是近年来也有一些学者开始了角膜玻璃化低温保存的研究。相对于慢

2、速冷冻法，玻璃化法操作简单，同时可以避免冰晶的生成，减小了对细胞的机械损伤。但是玻璃化法需要高浓度的保护剂，在保护剂的导入和洗脱过程中，不可避免地对细胞造成渗透损伤和毒性损伤。本文对角膜的慢速冻存方案、玻璃化保护剂的最佳导入和洗脱程序以及玻璃化低温冻存进行了较为系统的研究。首先，对角膜的慢速冻存进行了研究。通过实验研究了保护剂的导入洗脱方法、不同保护剂的种类和浓度对慢速冻存角膜的影响。实验结果发现，对于低浓度的保护剂来说，采用分步导入和洗脱方法并不能显著地提高内皮细胞的活率；采用10％DMSO作为保护剂进行慢速冻存后，角膜内皮细胞活率

3、最高，可以达到81％，而且细胞形态完整。其次，对含有39％1，2一PD+15％海藻糖的角膜玻璃化保护剂的导入洗脱程序进行了优化。通过实验研究了不同的操作温度、不同的导入洗脱方法、不同的分步导入和洗脱间隔时间以及连续导入的时间对角膜内皮细胞的影响。实验结果发现，操作温度越低，保护剂毒性越小；分步导入能减小渗透压差对细胞的损伤。得到了保护剂四步导入和四步洗脱过程，导入时间间隔为4分钟，洗脱时间间隔为3分钟的优化程序，能有效减小细胞所受到的渗透损伤和毒性损伤，使细胞保持形态学完整和功能正常。同时还根据玻璃化能力等因素配制了含有20％1’2．

4、PD+15％DMSO+15％海藻糖+5％聚乙二醇的新型联合玻璃化保护剂，并通过实验确定了该玻璃化保护剂四步导入和洗脱过程中的最佳间隔时间。实验结果发现，当导入间隔时间为3分钟，洗脱间隔时间为5分钟时，保护剂对细胞的损伤最小。最后，采用39％1，2．PD+15％海藻糖(PT)和20％1,2-PD+15％DMSO+15％海藻糖+5％聚乙二醇(PDTP)两种玻璃化保护剂，采用最佳的导入洗脱程序，进行角膜的玻璃化低温保存。实验结果发现，使用PT和PDTP作为保护剂进行角膜玻璃化冻存后，角膜内皮细胞活率分别为74．5±1．O％和77．6±1．4

5、％。绝大多数角膜内皮细胞能显示出边界轮廓，保持了细胞形态。PD卯比PT更能保持细胞形态学的完整性，提高内皮细胞活率。关键词：角膜；低温保存；玻璃化；冷冻保护剂角膜低温保存过程的研究CryopreservationProcessforComeasAbstractCryopreservationisatechniquethatofferstheprospectoflong-termstorageofcorneas．Successfulcornealcryopreservationwouldoffersufficientcornealgra

6、ftsforpenetratingkeratoplastyandwouldbeanewmethodfortheeye—bank．Themaintenanceofanintact,functionalcornealendothelialmonolayerplaysallimportantroleinthecryopreservationofcDmeas，whichisvitalforsustainingcornealthickness，transparencyanddehydratingcondition．Therearetwokind

7、soferyopresorvation：slowfreezingandvitrification．TheComeRsareusuallyeryopreservedusingtheslowfreezingmethod．Atpresent．someresearchersattempttOadoptvitrificationforcornealpreservation．Vitrificationisapromisingnovelandsimpleprocedurethatattemptstoeliminatetheformationofbo

8、thintracellularandextracellulariceduringtheprocessofcoolingandwarming,andvitrificationismorecompetitiveandeffe