凉血化瘀方拮抗内质网应激引起的L02肝细胞凋亡作用及机制研究-论文.pdf

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1、第38卷第2O期中圈中药杂畚V01．38．Issue202013年10月ChinaJourn。IofCneseateriaedicaOctober，2013凉血化瘀方拮抗内质网应激引起的L02肝细胞凋亡作用及机制研究姜泽群，姚志华，邓正亭，蒋鑫超，颜晓静，陈卫平(南京中医药大学，江苏南京210023)[摘要]内质网应激(endoplasmicreticulumstress，ERS)启动的细胞凋亡是近年才发现的一种新的凋亡途径，本研究从ERS途径探讨凉血化瘀方对肿瘤坏死因子Ot(TNF—Ot)和D

2、一氨基半乳糖(D．GaIN)所致肝细胞凋亡的保护作用。研究发现，TNF—Ot和D—Gain可明显抑制L02肝细胞增殖，诱导细胞凋亡，使细胞质内游离钙离子含量明显上升，并使ERS凋亡相关信号分子磷酸化PERK，磷酸化elF2a，cleavedCaspase一12，GRP78，CHOP的蛋白表达显著增加。不同浓度的凉血化瘀方作用后，与TNF·a／GaiN损伤组相比，可显著减轻L02肝细胞的增殖抑制、减少细胞的凋亡，抑制细胞质内游离钙离子含量的增高，并使磷酸化PERK，磷酸化elF2a，cleaved

3、Caspase一12，GRP78，CHOP的蛋白表达量呈逐渐下降的趋势。这些发现说明：凉血化瘀方对TNF—O／和D—GaIN所诱导的肝细胞凋亡具有抑制作用，其机制可能与维持内质网腔钙稳态平衡和下调ERS凋亡相关信号分子磷酸化PERK，磷酸化elF2a，cleavedCaspase一12，GRP78，CHOP的表达有关。[关键词]凉血化瘀方；肝细胞凋亡；内质网应激凉血化瘀方是在叶天士温病“凉血散血”基本相关信号分子磷酸化PERK，磷酸化elF2a，cleaved治法的基础上，结合多年临床治疗经验和

4、重型肝炎Caspase．12，GRP78，CHOP蛋白表达的影响，以期进瘀热相搏的病理特点而确立的方药，具有清热养阴、一步揭示该方抗肝细胞凋亡的机制。凉血化瘀、泻火解毒的作用¨，方药通过正交设计1材料优选最终由生地黄、制大黄、赤芍组成。前期研究结1．1细胞株人正常肝细胞株L02购自中国科学果显示凉血化瘀方对重型肝炎和实验性肝衰竭确有院上海生命科学研究院细胞库。较好的防治作用，对肝细胞凋亡有明显的干预作用，1．2药材凉血化瘀方药物组成：赤芍、生地黄、制初步探明了凉血化瘀法防治肝衰竭的作用机制是通大

5、黄。饮片在安徽省医药公司购买，由南京中医药过抗肝细胞凋亡保护肝细胞、减轻肝损伤而发挥良大学中药鉴定教研室鉴定，按照2005年版《中国药好的治疗作用。过度的内质网应激(ERS)可启典》一部各中药项下要求，进行相关质量分析包括动细胞凋亡，这一条信号转导通路被认为是除死亡主要成分含量测定，确保所用饮片质量符合药典的受体活化和线粒体损伤外又一条新的介导细胞凋亡规定。称取赤芍300g、生地黄200g、制大黄200g信号传导的通路。本实验拟在前期研究的基础置不锈钢锅中加水3000mL浸润1h，然后置电炉上，

6、利用肿瘤坏死因子O／(TNF一19／)和D．氨基半乳糖上加热煎煮3次，煎煮时间分别为1h，40min，40(D—GAIN)所诱导的肝细胞凋亡模型，观察凉血化瘀min，过滤合并滤液，浓缩，制成含生药量1g·mL方对内质网腔钙离子含量的调控，以及对ERS凋亡的母液，离心取上清，0．22m微孔滤膜过滤除菌，然后用无血清的培养液稀释成高、中、低剂量分别为[收稿日期]2013-04—181，0．1，0．01g·L一备用(前期细胞毒性试验结果显[基金项目]国家自然科学基金面上项目(81072777，8127

7、3638)；示，当凉血化瘀方质量浓度高于1g·L时，I／)2细江苏省高校优势学科建设工程项目(PAPD)；江苏省高等学校大学胞活性显著下降，而在0．1～1g·L。。时对细胞活力生创新训练计划项目(O110420010130，640)无明显影响)。[通信作者]陈卫平，教授，博士生导师，Tel：(025)85811923，1．3试剂DMEM高糖培养基、胎牛血清、培养基E-mail：wp2002123@163．con瓶、细胞培养瓶、6孔板、96孔板、胰蛋白酶、DMSO[作者简介]姜泽群，讲师，博士，T

8、el：(025)85811930，E-mail：jiangjzq@sina．com等均购自Gibco公司；D一氨基半乳糖(D-GaIN)，Fu-·3544·第38卷第2O期2013年10月鎏中China圈Joum烹。nesea杂teda志edicaV0Olc_t3o8be．Irs．su2e01320ra一2购自Sigma公司；人重组TNF一购于Cytolab／避光染色15min，用高内涵细胞成像分析系统检测PeprotechAsia公司：CCK一8细胞增殖与毒性检测试观察正常、早期凋亡和晚期凋亡